基因组编辑工具CRISPR-Casl2b/c2cl在植物中的应用探究
发布时间：2022-12-04 22:17
CRISPR/Cas系统作为第三代基因组编辑技术,具有简单、高效、灵活、低廉等优点,被广泛应用于多个物种的基因组编辑研究中,成为了生命科学领域的革命性工具。利用该系统可以实现对基因组目标位点的碱基插入、缺失、替换等操作,及靶向激活或抑制基因的表达。与此同时,对CRISPR/Cas系统的不断改造以及新型Cas蛋白的功能开发,使CRISPR系统正逐步成为一个理想的遗传修饰工具。CRISPR-Cas12b/C2c1系统属于class 2中的type V-B型的基因编辑系统。Cas12b蛋白具有一个保守的RuvC结构域和一个Nuc结构域,该蛋白需要crRNA和tracrRNA的共同引导,识别富含AT的PAM序列,切割DNA双链,产生5’粘性末端。为了验证CRISPR-Cas12b系统能否在植物中起到基因组编辑的作用,我们选择来自于Bacillussp.V3-13（Bv）和Bacillus hisashii（Bh）的Cas12b蛋白在拟南芥原生质体中进行验证。首先,通过添加核定位信号和密码子优化,实现了两蛋白在拟南芥原生质体细胞中的入核表达。其次,选择拟南芥PDS3、FLS2、GL2和TT4基因...
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 课题背景
1.2 基因组编辑的原理和类型
1.3 基因组编辑工具发展简述
1.3.1 第一代基因组编辑工具-ZFN
1.3.2 第二代基因组编辑工具-TALEN
1.3.3 第三代基因组编辑工具-CRISPR-Cas
1.4 基因组编辑技术在植物中的应用
1.4.1 ZFN在植物中的应用
1.4.2 TALEN在植物中的应用
1.4.3 CRISPR/Cas系统在植物中的应用
1.4.4 新型基因组编辑工具CRISPR/Cas12b的研究现状
1.5 选题意义
第2章 Cas12b蛋白的密码子优化及植物中的表达验证
2.1 实验材料与仪器
2.1.1 实验材料
2.1.2 试剂与仪器
2.2 实验方法
2.2.1 Cas12b蛋白的密码子优化及载体构建
2.2.2 Cas12b-EGFP 融合蛋白表达载体的构建
2.2.3 Cas12b-EGFP融合蛋白在本生烟植株中的表达验证
2.2.4 Cas12b-EGFP融合蛋白在拟南芥原生质体中的表达及亚细胞定位
2.3 实验结果与分析
2.3.1 Cas12b蛋白的密码子优化及载体构建的结果与分析
2.3.2 Cas12b-EGFP融合蛋白载体构建的结果及分析
2.3.3 Cas12b-EGFP融合蛋白在本生烟植株中的表达结果及分析
2.3.4 Cas12b-EGFP融合蛋白在拟南芥原生质体中的表达结果及分析
2.4 本章小结
第3章 Cas12b蛋白的细胞水平基因组编辑功能验证
3.1 实验材料与仪器
3.1.1 实验材料
3.1.2 试剂与仪器
3.2 实验方法
3.2.1 Cas12b蛋白单位点基因组编辑
3.2.2 Cas12b蛋白双位点基因组编辑
3.2.3 Cas12b蛋白大片段缺失基因组编辑
3.2.4 Cas12b蛋白脱靶效应检测
3.2.5 深度测序结果分析
3.3 实验结果与分析
3.3.1 基因组编辑靶点的设计结果及分析
3.3.2 Cas12b蛋白单位点基因组编辑结果及分析
3.3.3 Cas12b蛋白双位点基因组编辑结果及分析
3.3.4 Cas12b蛋白基因组编辑效率对比
3.3.5 Cas12b蛋白大片段缺失基因组编辑结果及分析
3.3.6 Cas12b蛋白脱靶效应检测
3.4 本章小结
第4章 Cas12b蛋白的植株水平基因组编辑功能验证
4.1 实验材料与仪器
4.1.1 实验材料
4.1.2 试剂与仪器
4.2 实验方法
4.2.1 拟南芥长日照植株的种植
4.2.2 农杆菌介导的拟南芥稳定转化
4.2.3 T1代阳性转化植株的筛选及检测
4.3 实验结果与分析
4.4 本章小结
结论
附录一
附录二
参考文献
攻读硕士学位期间所发表的论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas植物基因组编辑技术研究进展[J]. 刘耀光,李构思,张雅玲,陈乐天. 华南农业大学学报. 2019(05)
本文编号：3709090
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 课题背景
1.2 基因组编辑的原理和类型
1.3 基因组编辑工具发展简述
1.3.1 第一代基因组编辑工具-ZFN
1.3.2 第二代基因组编辑工具-TALEN
1.3.3 第三代基因组编辑工具-CRISPR-Cas
1.4 基因组编辑技术在植物中的应用
1.4.1 ZFN在植物中的应用
1.4.2 TALEN在植物中的应用
1.4.3 CRISPR/Cas系统在植物中的应用
1.4.4 新型基因组编辑工具CRISPR/Cas12b的研究现状
1.5 选题意义
第2章 Cas12b蛋白的密码子优化及植物中的表达验证
2.1 实验材料与仪器
2.1.1 实验材料
2.1.2 试剂与仪器
2.2 实验方法
2.2.1 Cas12b蛋白的密码子优化及载体构建
2.2.2 Cas12b-EGFP 融合蛋白表达载体的构建
2.2.3 Cas12b-EGFP融合蛋白在本生烟植株中的表达验证
2.2.4 Cas12b-EGFP融合蛋白在拟南芥原生质体中的表达及亚细胞定位
2.3 实验结果与分析
2.3.1 Cas12b蛋白的密码子优化及载体构建的结果与分析
2.3.2 Cas12b-EGFP融合蛋白载体构建的结果及分析
2.3.3 Cas12b-EGFP融合蛋白在本生烟植株中的表达结果及分析
2.3.4 Cas12b-EGFP融合蛋白在拟南芥原生质体中的表达结果及分析
2.4 本章小结
第3章 Cas12b蛋白的细胞水平基因组编辑功能验证
3.1 实验材料与仪器
3.1.1 实验材料
3.1.2 试剂与仪器
3.2 实验方法
3.2.1 Cas12b蛋白单位点基因组编辑
3.2.2 Cas12b蛋白双位点基因组编辑
3.2.3 Cas12b蛋白大片段缺失基因组编辑
3.2.4 Cas12b蛋白脱靶效应检测
3.2.5 深度测序结果分析
3.3 实验结果与分析
3.3.1 基因组编辑靶点的设计结果及分析
3.3.2 Cas12b蛋白单位点基因组编辑结果及分析
3.3.3 Cas12b蛋白双位点基因组编辑结果及分析
3.3.4 Cas12b蛋白基因组编辑效率对比
3.3.5 Cas12b蛋白大片段缺失基因组编辑结果及分析
3.3.6 Cas12b蛋白脱靶效应检测
3.4 本章小结
第4章 Cas12b蛋白的植株水平基因组编辑功能验证
4.1 实验材料与仪器
4.1.1 实验材料
4.1.2 试剂与仪器
4.2 实验方法
4.2.1 拟南芥长日照植株的种植
4.2.2 农杆菌介导的拟南芥稳定转化
4.2.3 T1代阳性转化植株的筛选及检测
4.3 实验结果与分析
4.4 本章小结
结论
附录一
附录二
参考文献
攻读硕士学位期间所发表的论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas植物基因组编辑技术研究进展[J]. 刘耀光,李构思,张雅玲,陈乐天. 华南农业大学学报. 2019(05)
本文编号：3709090
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/benkebiyelunwen/3709090.html