基于一种高效的CRISPR/Cas9技术初步研究拟南芥miR396的功能
发布时间：2022-12-05 18:49
miR396是植物体内一类高度保守的内源性非编码单链小RNA,在转录或转录后水平对靶基因的表达发挥调控作用,参与植物的生长发育、形态建成、激素应答以及生物与非生物胁迫等多种生理生化反应。为初步探讨AtmiR396对拟南芥生长发育的影响,本文以哥伦比亚野生型拟南芥以及利用CRISPR/Cas9基因定点编辑技术所获得的AtmiR396纯合突变体为研究对象,通过观测表型、测定抗氧化酶的活性、比较miR396的靶基因GRFs以及CKXs基因的表达、分析差异表达基因（DEGs）以初步确定拟南芥AtmiR396的功能。主要研究内容与结果如下:1.根据AtmiR396a和AtmiR396b序列分别设计2个sgRNA,经PCR扩增目的片段大小在500-750 bp之间,与预期扩增长度592 bp大小相一致。Bsa1酶切pHDE-mCherry质粒,质粒线性化,可与目的片段组装成重组质粒pHDE-mCherry-AtmiR396。重组质粒转化DH5α感受态细胞,菌液PCR鉴定结果显示,目标条带大小位于500-750 bp之间,与预期大小相符。提取重组质粒进行质粒PCR鉴定,条带大小符合预期,初步判定pH...
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略词表
第一章 绪论
1.1 miRNA概述
1.1.1 miRNA的发现
1.1.2 miRNA的合成机制
1.1.3 miRNA的作用机理
1.1.4 miRNA的功能
1.1.5 植物miRNA功能的研究方法
1.2 植物miR396 功能及研究进展
1.2.1 miR396 简介
1.2.2 miR396 在植物生长发育中的作用
1.2.3 miR396 在植物胁迫应答反应中的调控作用
1.3 CRISPR/Cas9 技术发展及其在植物中的应用进展
1.3.1 CRISPR/Cas9 系统的组成及工作原理
1.3.2 CRISPR/Cas9 系统的不足
1.3.3 CRISPR/Cas9 技术在植物基因组定向编辑中的应用
1.4 研究内容、目的意义及技术路线
1.4.1 研究内容
1.4.2 研究目的及意义
1.4.3 技术路线
第二章 材料与方法
2.1 材料与试剂
2.1.1 试验材料
2.1.2 主要试剂
2.2 仪器与设备
2.3 试验方法
2.3.1 拟南芥AtmiR396的CRISPR/Cas9 载体构建
2.3.2 重组质粒pHDE-mCherry-AtmiR396 转化拟南芥
2.3.3 转化后代的筛选与鉴定
2.3.4 突变体的表型观测
2.3.5 抗氧化酶活性的测定
2.3.6 AtmiR396a突变体GRFs与 CKXs基因的表达差异研究
2.3.7 拟南芥AtmiR396a突变体的转录组分析
2.4 数据处理
2.4.1 抗氧化酶活性的数据处理
2.4.2 AtmiR396a突变体GRFs与 CKXs基因的表达差异数据处理
第三章 结果与分析
3.1 pHDE-mCherry-AtmiR396 表达载体构建
3.2 重组质粒pHDE-mCherry-AtmiR396 转化拟南芥
3.3 转化后代的筛选与鉴定
3.3.1 T_0 代转化后代的可视化筛选
3.3.2 T1 突变后代的筛选及外源转化元件的验证
3.3.3 T2 突变后代的稳定遗传鉴定及外源转化元件分离验证
3.3.4 突变体的表型观测
3.4 抗氧化酶的活性测定
3.4.1 SOD活性的测定
3.4.2 POD活性的测定
3.4.3 CAT活性的测定
3.4.4 PPO活性的测定
3.5 AtmiR396a突变体GRFs与 CKXs基因的表达差异研究
3.5.1 RNA的提取
3.5.2 GRFs与 CKXs的扩增效果研究
3.5.3 基因表达分析
3.6 拟南芥AtmiR396a突变体的转录组分析
3.6.1 RNA-seq测序质量评估
3.6.2 差异表达基因分析
3.6.3 差异表达基因GO富集分析
3.6.4 差异表达基因KEGG富集分析
第四章 讨论
4.1 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的优势
4.2 抗氧化酶活性研究
4.3 AtmiR396a突变体GRFs与 CKXs基因的表达差异研究
4.4 拟南芥AtmiR396a突变体的转录组分析
第五章 结论与展望
5.1 结论
5.2 展望
参考文献
作者简介
导师简介
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于Cas9-Free的拟南芥ALB3基因编辑载体构建及验证[J]. 马铭赛,布梁灏,陈自银,黄嘉玲,欧阳乐军,李莉梅,王玉涛. 华北农学报. 2020(01)
[2]一种拟南芥基因高效编辑体系研究[J]. 欧阳乐军,马铭赛,陈梓洛,黄嘉玲,布梁灏,陈自银,李莉梅. 植物研究. 2019(06)
[3]巨桉miR156 CRISPR/Cas9载体构建[J]. 欧阳乐军,袁玉梅,李莉梅,陈剀钊,戴发. 森林与环境学报. 2018(04)
[4]玫瑰花多酚氧化酶的酶学特性研究[J]. 姬懿珊,冯作山,刘峰娟,刘伟君,陶永霞. 新疆农业大学学报. 2018(03)
[5]毛竹miR164b前体的克隆及其在叶形态建成中的功能分析[J]. 王丽丽,李利超,孙化雨,赵韩生,高志民. 植物科学学报. 2017(04)
[6]miR396-GRF模块:水稻分子育种的新资源[J]. 刘玲童,王台. 植物学报. 2016(02)
[7]CRISPR/Cas技术研究进展[J]. 常振仪,严维,刘东风,陈竹锋,谢刚,卢嘉威,吴建新,唐晓艳. 农业生物技术学报. 2015(09)
[8]两种检测SOD酶活性方法的比较[J]. 曲敏,秦丽楠,刘羽佳,范宏臣,朱姝,王金凤. 食品安全质量检测学报. 2014(10)
[9]植物安全转基因技术研究现状与展望[J]. 王根平,杜文明,夏兰琴. 中国农业科学. 2014(05)
[10]植物激素相关microRNA研究进展[J]. 曹慧颖,王可,高何瑞,张立军,夏润玺. 植物生理学报. 2013(11)
博士论文
[1]miR396在番茄果实生长发育中的功能研究[D]. 曹东艳.中国农业大学 2018
[2]赤霉素对细胞壁组分以及拟南芥主根伸长的影响[D]. 李桂俊.南京农业大学 2015
硕士论文
[1]开花与未开花三月竹几种重要代谢物差异研究[D]. 王双燕.四川农业大学 2015
[2]糖对拟南芥幼苗初生根生长影响的研究[D]. 王治.中央民族大学 2011
[3]MiR396在烟草中的功能分析[D]. 杨凤玺.中国科学院研究生院（西双版纳热带植物园） 2009
本文编号：3710164
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略词表
第一章 绪论
1.1 miRNA概述
1.1.1 miRNA的发现
1.1.2 miRNA的合成机制
1.1.3 miRNA的作用机理
1.1.4 miRNA的功能
1.1.5 植物miRNA功能的研究方法
1.2 植物miR396 功能及研究进展
1.2.1 miR396 简介
1.2.2 miR396 在植物生长发育中的作用
1.2.3 miR396 在植物胁迫应答反应中的调控作用
1.3 CRISPR/Cas9 技术发展及其在植物中的应用进展
1.3.1 CRISPR/Cas9 系统的组成及工作原理
1.3.2 CRISPR/Cas9 系统的不足
1.3.3 CRISPR/Cas9 技术在植物基因组定向编辑中的应用
1.4 研究内容、目的意义及技术路线
1.4.1 研究内容
1.4.2 研究目的及意义
1.4.3 技术路线
第二章 材料与方法
2.1 材料与试剂
2.1.1 试验材料
2.1.2 主要试剂
2.2 仪器与设备
2.3 试验方法
2.3.1 拟南芥AtmiR396的CRISPR/Cas9 载体构建
2.3.2 重组质粒pHDE-mCherry-AtmiR396 转化拟南芥
2.3.3 转化后代的筛选与鉴定
2.3.4 突变体的表型观测
2.3.5 抗氧化酶活性的测定
2.3.6 AtmiR396a突变体GRFs与 CKXs基因的表达差异研究
2.3.7 拟南芥AtmiR396a突变体的转录组分析
2.4 数据处理
2.4.1 抗氧化酶活性的数据处理
2.4.2 AtmiR396a突变体GRFs与 CKXs基因的表达差异数据处理
第三章 结果与分析
3.1 pHDE-mCherry-AtmiR396 表达载体构建
3.2 重组质粒pHDE-mCherry-AtmiR396 转化拟南芥
3.3 转化后代的筛选与鉴定
3.3.1 T_0 代转化后代的可视化筛选
3.3.2 T1 突变后代的筛选及外源转化元件的验证
3.3.3 T2 突变后代的稳定遗传鉴定及外源转化元件分离验证
3.3.4 突变体的表型观测
3.4 抗氧化酶的活性测定
3.4.1 SOD活性的测定
3.4.2 POD活性的测定
3.4.3 CAT活性的测定
3.4.4 PPO活性的测定
3.5 AtmiR396a突变体GRFs与 CKXs基因的表达差异研究
3.5.1 RNA的提取
3.5.2 GRFs与 CKXs的扩增效果研究
3.5.3 基因表达分析
3.6 拟南芥AtmiR396a突变体的转录组分析
3.6.1 RNA-seq测序质量评估
3.6.2 差异表达基因分析
3.6.3 差异表达基因GO富集分析
3.6.4 差异表达基因KEGG富集分析
第四章 讨论
4.1 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的优势
4.2 抗氧化酶活性研究
4.3 AtmiR396a突变体GRFs与 CKXs基因的表达差异研究
4.4 拟南芥AtmiR396a突变体的转录组分析
第五章 结论与展望
5.1 结论
5.2 展望
参考文献
作者简介
导师简介
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于Cas9-Free的拟南芥ALB3基因编辑载体构建及验证[J]. 马铭赛,布梁灏,陈自银,黄嘉玲,欧阳乐军,李莉梅,王玉涛. 华北农学报. 2020(01)
[2]一种拟南芥基因高效编辑体系研究[J]. 欧阳乐军,马铭赛,陈梓洛,黄嘉玲,布梁灏,陈自银,李莉梅. 植物研究. 2019(06)
[3]巨桉miR156 CRISPR/Cas9载体构建[J]. 欧阳乐军,袁玉梅,李莉梅,陈剀钊,戴发. 森林与环境学报. 2018(04)
[4]玫瑰花多酚氧化酶的酶学特性研究[J]. 姬懿珊,冯作山,刘峰娟,刘伟君,陶永霞. 新疆农业大学学报. 2018(03)
[5]毛竹miR164b前体的克隆及其在叶形态建成中的功能分析[J]. 王丽丽,李利超,孙化雨,赵韩生,高志民. 植物科学学报. 2017(04)
[6]miR396-GRF模块:水稻分子育种的新资源[J]. 刘玲童,王台. 植物学报. 2016(02)
[7]CRISPR/Cas技术研究进展[J]. 常振仪,严维,刘东风,陈竹锋,谢刚,卢嘉威,吴建新,唐晓艳. 农业生物技术学报. 2015(09)
[8]两种检测SOD酶活性方法的比较[J]. 曲敏,秦丽楠,刘羽佳,范宏臣,朱姝,王金凤. 食品安全质量检测学报. 2014(10)
[9]植物安全转基因技术研究现状与展望[J]. 王根平,杜文明,夏兰琴. 中国农业科学. 2014(05)
[10]植物激素相关microRNA研究进展[J]. 曹慧颖,王可,高何瑞,张立军,夏润玺. 植物生理学报. 2013(11)
博士论文
[1]miR396在番茄果实生长发育中的功能研究[D]. 曹东艳.中国农业大学 2018
[2]赤霉素对细胞壁组分以及拟南芥主根伸长的影响[D]. 李桂俊.南京农业大学 2015
硕士论文
[1]开花与未开花三月竹几种重要代谢物差异研究[D]. 王双燕.四川农业大学 2015
[2]糖对拟南芥幼苗初生根生长影响的研究[D]. 王治.中央民族大学 2011
[3]MiR396在烟草中的功能分析[D]. 杨凤玺.中国科学院研究生院（西双版纳热带植物园） 2009
本文编号：3710164
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