基于Cas9质粒的重构及微藻电转化条件的研究

发布时间：2023-04-02 12:28

　　小球藻繁殖迅速,易培养,可作为生物反应器的模式菌株;藻中含有的多种营养物质和活性成分,可以具有提高人体免疫力、具有抗氧化、抗肿瘤等功能。为了提高微藻生物质生产的能力或者获某些特异性能,基因突变或基因编辑是目前最为经济和迅速地研究方法,其中CRISPR/Cas9系统因具有操作简单,精确度高等优势,成为小球藻基因编辑体系中研究重点。目前通过电转化将带有特定基因工程选择标记的Cas9质粒,转化到小球藻中尚未见报道。本论文将通过优化电容、电压、电阻等电转化条件,探索带有G418抗性的Cas9质粒导入小球藻中的方法,以便建立微藻的电转化体系。首先,利用BG11培养基,通过平板划线法从河北的4条河流水域中筛选得到4株微藻。通过建立镜检并结合18S rDNA序列选择其中的一株球藻作为实验藻株。测定了实验藻株680nm处的OD值并绘制生长曲线,观察其对不同浓度的G418、氨苄氯霉素、卡那霉素和潮霉素的敏感性,确立了G418可以作为为小球藻基因工程筛选标记。其次选取了含NEO启动子(含有G418抗性)基因的植物双元表达载体pBI121质粒,针对该质粒的NEO启动子基因序列设计了带有HindIII酶切位点...

【文章页数】：55 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
1 引言
    1.1 微藻概述
        1.1.1 微藻的概念和分类
        1.1.2 小球藻的结构及生长特性
        1.1.3 小球藻的用途
    1.2 CRISPR/Cas9 技术的研究进展
    1.3 电转化技术的应用
    1.4 项目的研究意义
    1.5 本项目的研究方法及技术路线
2 小球藻的筛选及抗生素选择标记的确定
    2.1 实验材料
        2.1.1 水样来源
        2.1.2 主要实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 培养基制备
        2.2.2 藻株筛选
        2.2.3 微藻基因组的提取
        2.2.4 18SrDNA的扩增及测序
        2.2.5 进化树构建
        2.2.6 标记抗生素的配制和使用浓度
    2.3 结果与分析
        2.3.1 藻株筛选结果
        2.3.2 藻株鉴定结果
        2.3.3 BY藻株对抗生素敏感性
    2.4 讨论
    2.5 小结
3 pRGE31 载体的重构
    3.1 实验材料
        3.1.1 质粒、菌株及主要工具酶
        3.1.2 分析软件及数据库
        3.1.3 实验试剂
        3.1.4 培养基的配置
    3.2 实验方法
        3.2.1 载体构建
        3.2.2 连接产物转化
        3.2.3 产物与线性化pRGE31 连接
    3.3 结果与分析
        3.3.1 目标基因的获得结果
        3.3.2 pRGE31 经酶切线性化结果
        3.3.3 重组质粒的筛选结果
        3.3.4 重组质粒鉴定
        3.3.5 重组质粒测序结果
    3.4 讨论
    3.5 小结
4 微藻电击转化条件探究
    4.1 实验材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 质粒及菌株
    4.2 实验方法
        4.2.1 藻种BY感受态细胞的制备
        4.2.2 藻种BY电转化条件的优化
        4.2.3 响应面优化
        4.2.4 DNA的提取
        4.2.5 重组质粒pRGE31 转化子的筛选
    4.3 实验结果与分析
        4.3.1 藻种BY电转化条件的优化结果
        4.3.2 响应面的实验结果与分析
        4.3.3 重组质粒转化藻种BY
    4.4 讨论
    4.5 小结
5 结论与展望
    5.1 结论
        5.1.1 小球藻的筛选及抗生素选择标记的确定
        5.1.2 pRGE31 载体的重构
        5.1.3 小球藻电击转化条件探究
    5.2 展望
参考文献
附录
    附录 A 实验仪器
    附录 B 实验试剂
    附录 C 文中涉及的测序序列
作者简历
致谢



本文编号：3779225