邻苯二甲酸二甲酯人工抗原包被的酶联免疫分析法的建立

发布时间：2017-03-31 04:24

  本文关键词：邻苯二甲酸二甲酯人工抗原包被的酶联免疫分析法的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：邻苯二甲酸二甲酯(Dimethylphthalate, DMP),是邻苯二甲酸酯类化合物中的一种,主要作为增塑剂应用于食品包装、医疗设备、建筑装修材料以及家庭生活用品中。随着增塑剂的广泛使用,DMP被大量释放出来进入环境。环境中的DMP可通过呼吸或饮食等方式被人体吸收。研究发现：DMP对人体健康具有毒性作用,已被我国列为优先控制的环境污染物。目前,国内外对DMP的检测方法主要有气相色谱(Gas chromatography, GC)、高效液相色谱(High performance liquid chromatography, HPLC)和气相色谱-质谱(Ga schromatography-mass spectrometry, GC-MS)联用技术,这些方法都能精确地检测出DMP的含量,但样品前期处理操作复杂、耗时长,需要高档的仪器设备,不便于现场检测。为方便测定DMP在环境中的污染水平,建立一种快速、简便、灵敏度高、低成本的方法检测环境和生活用品中DMP的含量具有重要的科学意义。酶联免疫分析(Enzyme-linked immmosorbent assay, ELISA)具有操作简便快速、灵敏度高、不需昂贵的仪器设备、可在现场一次检测多个样本等优点,被认为是现场检测环境污染物的经典方法。本研究采用重氮法将小分子化合物4-氨基邻苯二甲酸二甲酯(Dimethyl-4-amino phthalate, DMAP)与牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)和卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)进行偶联合成人工抗原DMAP-BSA和DMAP-OVA。通过筛选,选用DMAP-BSA作为免疫原免疫Balb/c小鼠。6次免疫结束后,获得高效价和高灵敏度抗血清。采用杂交瘤技术融合免疫效果最佳小鼠的脾细胞和SP2/0细胞,通过ELISA法检测杂交瘤细胞阳性和对DMP的特异性,筛选出一株能稳定分泌DMP单克隆抗体细胞株DMP-2C11,夹心ELISA法检测出DMP-2C11细胞株分泌抗体的亚型是IgG2ao DMP-2C11细胞株扩大培养后,通过小鼠腹水法大量制备DMP的单克隆抗体,辛酸-硫酸铵法提纯腹水抗体,方阵滴定法确定最佳人工抗原包被浓度为0.5μg/mL,单抗最佳稀释倍数为4000。ELISA最适检测条件：5%脱脂奶粉作封闭剂、二抗反应温度为37℃,邻苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)作显色剂。建立的人工抗原包被的ELISA标准曲线y=19.68Log(x)+20.71,相关系数R2为0.993,线性检测范围是0.92～1029.68μg/L,最低检测限(LD)即IC1o为0.28μg/L,表明该DMP抗体可满足环境中DMP含量的检测。
【关键词】：邻苯二甲酸二甲酯(DMP) 人工抗原 杂交瘤 酶联免疫分析(ELISA)
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X830.2
【目录】：

• 摘要6-7
• Absract7-11
• 1. 绪论11-19
• 1.1 邻苯二甲酸二甲酯的性质及应用11
• 1.2 环境中的邻苯二甲酸二甲酯11-12
• 1.2.1 大气环境中11-12
• 1.2.2 土壤环境中12
• 1.2.3 水体环境中12
• 1.3 邻苯二甲酸二甲酯的危害12-13
• 1.4 PAEs的检测方法13-16
• 1.4.1 色谱法(Chromatography)13-15
• 1.4.2 免疫分析法(IA)15-16
• 1.4.3 生物素-亲和素放大酶联免疫分析(BA-ELISA)16
• 1.5 小分子的酶联免疫分析技术(ELISA)16-18
• 1.5.1 人工抗原制备16-17
• 1.5.2 单克隆抗体制备17-18
• 1.6 研究目的及意义18-19
• 2. 材料与方法19-32
• 2.1 材料、试剂与仪器19-22
• 2.1.1 材料19
• 2.1.2 主要试剂19
• 2.1.3 主要溶液19-22
• 2.1.4 主要实验仪器22
• 2.2 实验方法22-32
• 2.2.1 人工抗原合成22-23
• 2.2.2 人工抗原纯化23
• 2.2.3 人工抗原蛋白含量测定23-24
• 2.2.4 人工抗原结构鉴定24
• 2.2.5 Balb/c小鼠的免疫24
• 2.2.6 ELISA方阵滴定24-25
• 2.2.7 抗血清效价测定25
• 2.2.8 抗血清灵敏度测定25-26
• 2.2.9 单克隆抗体制备26-29
• 2.2.10 杂交瘤细胞染色体分析29
• 2.2.11 单克隆抗体亚型分析29-30
• 2.2.12 单克隆抗体纯化30
• 2.2.13 优化ELISA检测条件30-32
• 3. 结果与分析32-45
• 3.1 人工抗原鉴定32-34
• 3.1.1 UV扫谱鉴定32-33
• 3.1.2 SDS-PAGE鉴定33-34
• 3.2 人工抗原含量测定34
• 3.3 ELISA法方阵滴定34-35
• 3.4 测定抗血清效价35-36
• 3.5 抗血清灵敏度测定36
• 3.6 细胞融合实验36-37
• 3.7 杂交瘤细胞克隆化37-38
• 3.8 杂交瘤细胞株扩大培养38
• 3.9 杂交瘤染色体分析38-39
• 3.10 单克隆抗体亚型分析39
• 3.11 单克隆抗体的纯化39-40
• 3.12 人工抗原包被的间接竞争ELISA标准曲线的建立40-45
• 3.12.1 间接竞争ELISA条件优化40-43
• 3.12.2 建立人工抗原包被的间接竞争ELISA标准曲线43-45
• 4. 讨论45-49
• 4.1 邻苯二甲酸二甲酯人工抗原的合成45
• 4.2 免疫方案的确定45-46
• 4.3 单克隆抗体制备46-48
• 4.3.1 细胞融合46
• 4.3.2 杂交瘤细胞的培养46-47
• 4.3.3 杂交瘤细胞的筛选47
• 4.3.4 杂交瘤细胞克隆化47
• 4.3.5 杂交瘤细胞冻存与复苏47
• 4.3.6 单克隆抗体纯化47-48
• 4.4 反应条件对人工抗原包被间接竞争ELISA的影响48
• 4.5 间接ELISA检测注意事项48-49
• 5. 结论与展望49-50
• 参考文献50-55
• 附录1 主要英文缩写词55-56
• 附录2 攻读学位期间论文发表情况56-57
• 致谢57

【参考文献】

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