KPNA2过表达促进rtA181T突变型乙肝病毒表面蛋白入核上调肝细胞c-Myc表达

发布时间：2021-06-23 05:45

　　目的:构建p-KPNA2、p-HBs Ag、p-HBs Agt三种质粒,通过分组分别转染Hep G2细胞、LO2细胞和293T细胞,探讨KPNA2过表达在rt A181T型乙肝病毒表面蛋白上调c-Myc表达过程中的作用。方法:（1）从Gen Bank中分别查找KPNA2、HBs Ag的m RNA序列,利用primer premier 5.0软件设计引物,应用RT-PCR方法获得目的片段,双酶切后与真核表达质粒连接,从而构建成p-KPNA2、p-HBs Ag质粒;（2）以构建好的p-HBs Ag质粒为模板,采用定点突变方法使其产生rt A181T突变以构建p-HBs Agt质粒;（3）分组与转染:①p-HBs Ag组、②p-HBs Agt组、③p-KPNA2组、④p-KPNA2+p-HBs Ag组、⑤p-KPNA2+p-HBs Agt组、⑥空载质粒组,共6组;分别转染Hep G2细胞、LO2细胞、293T细胞;（4）检测:转染48h后,采用Ligand绿色荧光染料染色技术检测KPNA2的细胞内分布;收集细胞总蛋白,western blot检测目的蛋白的表达并进行灰度值分析;收集细胞总RN... 

【文章来源】：南昌大学江西省 211工程院校

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
中英文对照词表
第1章 引言
第2章 材料与方法
    2.1 实验主要试剂和材料
    2.2 实验主要设备和仪器
    2.3 实验主要试剂的配制
    2.4 pFC14A-KPNA2 质粒的构建
        2.4.1 KPNA2 基因mRNA序列的引物设计
        2.4.2 提取HepG2 细胞总RNA
        2.4.3 RNA逆转录成cDNA
        2.4.4 PCR扩增KPNA2 基因
        2.4.5 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳回收
        2.4.6 回收产物和pFC14A质粒的双酶切，回收以及连接
        2.4.7 质粒的转化，筛选，提取和鉴定
    2.5 pcDNA3.1-HBsAg质粒的构建
    2.6 pcDNA3.1-HBsAgt质粒的构建
        2.6.1 点突变引物的设计
        2.6.2 PCR反应程序
    2.7 pFC14A-KPNA2 质粒转染HepG2 细胞
    2.8 pcDNA3.1-HBsAg质粒转染HepG2 细胞
    2.9 HepG2 细胞免疫荧光实验
    2.10 p-KPNA2、p-HBsAg、p-HBsAgt三种质粒的共转染
    2.11 western blot检测HepG2、LO2 和 293T细胞内c-Myc表达水平
        2.11.1 细胞中总蛋白的提取
    2.12 RTFQ-PCR检测LO2 细胞中c-Myc的mRNA表达水平
        2.12.1 RNA提取
        2.12.2 逆转录反应
        2.12.3 荧光定量PCR反应体系和程序
    2.13 数据处理
第3章 结果
    3.1 成功构建pFC14A-KPNA2 质粒
        3.1.1 pFC14A-KPNA2 质粒酶切结果鉴定
        3.1.2 pFC14A-KPNA2 质粒测序结果鉴定
    3.2 成功构建pcDNA3.1-HBsAg质粒
        3.2.1 pcDNA3.1-HBsAg质粒双酶切鉴定结果
        3.2.2 pcDNA3.1-HBsAg质粒测序鉴定结果
    3.3 成功构建pcDNA3.1-HBsAgt质粒
        3.3.1 pcDNA3.1-HBsAgt质粒双酶切鉴定结果
        3.3.2 pcDNA3.1-HBsAgt质粒测序鉴定结果
    3.4 pFC14A-KPNA2 质粒转染HepG2 细胞
    3.5 pcDNA3.1-HBsAg质粒转染HepG2 细胞
    3.6 c-Myc在HepG2 细胞中的表达水平
    3.7 c-Myc在LO2 细胞中的表达水平
    3.8 c-Myc在 293T细胞中的表达水平
    3.9 LO2 细胞中p-HBsAg组、p-HBsAgt组和p-HBsAgt+p-KPNA2 组的c-Myc的mRNA表达水平
    3.10 p-HBsAgt对不同细胞中c-Myc的表达影响
第4章 讨论
第5章 结论
致谢
参考文献
综述
    参考文献


【参考文献】：
期刊论文
[1]Antiviral therapies for hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma[J]. Yuan-Qing Zhang,Jin-Sheng Guo.  World Journal of Gastroenterology. 2015(13)
[2]340例慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒多位点耐药相关突变分析[J]. 徐东平,刘妍,成军,李晓东,戴久增,李乐,梁兆玲,白丽,钟彦伟,许智慧,任晓强,张玲霞.  中华肝脏病杂志. 2008 (10)
[3]羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的研究[J]. 成军,刘妍,洪源,王建军,杨倩.  世界华人消化杂志. 2003(08)
[4]决定乙肝病毒嗜肝特性的分子机制[J]. 成军.  国外医学.病毒学分册. 1995(03)



本文编号：3244356