葛根素预处理上调内皮型一氧化氮合酶的表达减轻人脐静脉内皮细胞缺氧/复氧损伤
发布时间：2021-09-29 15:25
目的:探讨葛根素（puerarin,PUE）预处理对缺氧/复氧（hypoxia reoxygenation,H/R）损伤的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的保护作用。方法:HUVECs随机分为正常对照（control）组、H/R组、单纯PUE组和PUE+H/R组(1.0×10-3mol/L PUE预处理24 h后进行H/R)。采用Western blot方法检测内皮型一氧化氮合酶（e NOS）蛋白的表达,化学比色法检测组成型一氧化氮合酶（c NOS）的活性,TUNEL法检测细胞凋亡。此外,在PUE预处理前使用ERK蛋白激酶抑制剂U0126(1.0×10-5mol/L)或PI3K/Akt蛋白激酶抑制剂LY294002(5.0×10-5mol/L)处理细胞1 h,再进行H/R。结果:与control组相比,H/R组的e NOS蛋白表达水平降低（P<0.05）,PUE预处理上调e NOS蛋白的表达水平（P<0.05）,该上调作用均可被U0126及LY294002抑制（P<0.05）;与control组相比,H...
【文章来源】：中国病理生理杂志. 2016,32(05)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
Ⅷ因子相关抗原和CD34在HUVECs细胞中的表达
Figure2．TheproteinexpressionofeNOSintheHUVECstreatedwithH/Ｒand/orPUE．Mean±SD．n=9．▲P＜0.05vscontrolgroup;#P＜0.05vsH2/Ｒ4group;△P＜0.05vsH4/Ｒ4group;*P＜0.05vsH8/Ｒ4group;☆P＜0.05vsPUEgroup．图2H/Ｒ与PUE预处理各组eNOS蛋白表达3PUE预处理增加cNOS活性如图3所示，与control组相比较，随着缺氧时间延长，H/Ｒ各组细胞cNOS活性逐渐降低(P＜0.05)，与同时点H/Ｒ组比较，应用PUE预处理后各组cNOS活性明显增加(P＜0.05)。Figure3．ThechangesofcNOSactivityineachgroup．Mean±SD．n=3．▲P＜0.05vscontrolgroup;#P＜0.05vsH2/Ｒ4group;△P＜0.05vsH4/Ｒ4group;*P＜0.05vsH8/Ｒ4group;☆P＜0.05vsPUEgroup．图3各组cNOS活性的变化4PUE预处理减少HUVECs细胞凋亡Control组及PUE组细胞生长良好，仅偶见细胞凋亡发生。H4/Ｒ4组细胞凋亡指数明显高于control组(P＜0.01);经PUE预处理后，细胞凋亡指数明显降低(P＜0.01)，见图4、5。Figure4．TheapoptosisofHUVECs(TUNEL，×200)．A:negativecontrolgroup;B:controlgroup;C:H4/Ｒ4group;D:PUEgroup;E:PUE+H4/Ｒ4group．图4HUVECs细胞凋亡情况5UO126及LY294002抑制PUE预处理上调的eNOS蛋白表达如图6所示，与control组相比，H4/Ｒ4组eNOS蛋白表达水平降低(P＜0.05)，单纯PUE预处理组和PUE+H4/Ｒ4组eNOS蛋白表达水平显著增加(P＜0.05);与H4/Ｒ4组相比，PUE组和PUE+H4/Ｒ4组eNOS蛋白表达水平明显增加(P＜0.05);与单纯PUE预处理组比较，U0126+PUE+H4/Ｒ4组、U0126+PUE组、LY294002+PUE+H4/Ｒ4组和LY294002+PUE组eNOS蛋白表达水平降低(P＜·860·
?和LY294002+PUE组eNOS蛋白表达水平降低(P＜0.05);与control组相比，U0126组、LY294002组和DMSO组eNOS蛋白表达水平的差异无统计学显著性。讨论当IＲI发生时，血管内皮细胞的功能异常发生时间早于实质细胞的损伤，且内皮细胞受损可引起血栓和粥样斑块形成、血管痉挛，进一步使实质细胞的Figure6．U0126andLY294002inhibitedtheproteinexpressionofeNOSup-regulatedbyPUEpretreatment．Mean±SD．n=9．▲P＜0.05vscontrolgroup;△P＜0.05vsH4/Ｒ4group;#P＜0.05vsPUEgroup;*P＜0.05vsPUE+H4/Ｒ4group．图6U0126及LY294002抑制PUE预处理上调的eNOS蛋白表达损伤加剧，因此有效保护血管内皮细胞是预防和治疗IＲI损伤的关键。本实验使用的HUVECs经鉴定为高纯度内皮细胞，因此可用于模拟血管内皮在H/Ｒ损伤时结构和功能的改变。正常情况下，血管内皮细胞可以通过eNOS分泌适量的NO来维持细胞正常氧化还原自稳态。然而在H/Ｒ后，内皮细胞可迅速生成大量的氧自由基，如超氧阴离子(O－·2)、羟自由基(OH－)等。有研究证实氧自由基可下调eNOS的mＲNA和eNOS蛋白表达［6］，我们也观察到内皮细胞在不同时点H/Ｒ后eNOS蛋白表达降低。本研究还测定了H/Ｒ后NOS活性，结果发现cNOS活性逐渐降低。cNOS包括了eNOS和神经元型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase，nNOS)，因此cNOS活性应为两者活性之和。nNOS主要表达于神经细胞中，本实验过程中通过Westernblot方法检测了各组内皮细胞中nNOS蛋白表达，但未测出，且本课题组前期研究中使用免疫组化的方法也发现nNOS在血管内皮细胞中表达水平很低［7］，故本实验中测定的cNOS活性主要为eNOS活性，可见H/Ｒ后eNOS活性是明显降低的。PUE是从豆科植物葛根提取
【参考文献】：
期刊论文
[1]依普利酮对高盐诱导的高血压大鼠主动脉内皮型一氧化氮合酶表达及活性的影响[J]. 张倩,丁菁,杨飞,王胜男,粟凤,陆德琴. 中国病理生理杂志. 2015(09)
[2]葛根素通过ERK1/2信号通路促进内皮细胞增殖[J]. 唐哲明,梁国荣. 四川生理科学杂志. 2012(02)
[3]葛根素治疗相关疾病的研究[J]. 韩春妍. 实用药物与临床. 2012(03)
[4]葛根素对过氧化氢诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用[J]. 高培国,强辉,凌鸣. 西安交通大学学报(医学版). 2012(02)
[5]葛根素通过PI3K/Akt途径对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的抑制[J]. 马亚飞,刘新伟,乔欣,王群英,杨海燕. 中国老年学杂志. 2010(08)
[6]葛根素对心肌细胞一氧化氮影响的研究[J]. 温葭,陈士林,Filly Cheung,郝雪娜. 中国心血管病研究杂志. 2006(10)
[7]葛根素对血管内皮细胞DNA损伤的保护作用[J]. 王春玲,傅攀峰,李宏伟,张静,修瑞娟. 中国微循环. 2004(06)
[8]缺氧与复氧对脑动脉内皮细胞一氧化氮合酶Ⅲ表达的影响[J]. 宋振举,杨光田,陆德琴,王迪浔. 中国危重病急救医学. 2003(09)
[9]NO在血管内皮细胞损伤中的标志作用[J]. 杨春华,林水金,杨映波,冯素珍. 急诊医学. 1999(03)
[10]卡托普利晚期预处理对人内皮细胞缺氧复氧损伤保护作用机制的研究[J]. 徐慧,文薏,谭虹. 中国心血管病研究杂志. 2013 (04)
硕士论文
[1]葛根素调节支架内狭窄炎症反应的机制研究[D]. 刘青.北京中医药大学 2007
本文编号：3413952
【文章来源】：中国病理生理杂志. 2016,32(05)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
Ⅷ因子相关抗原和CD34在HUVECs细胞中的表达
Figure2．TheproteinexpressionofeNOSintheHUVECstreatedwithH/Ｒand/orPUE．Mean±SD．n=9．▲P＜0.05vscontrolgroup;#P＜0.05vsH2/Ｒ4group;△P＜0.05vsH4/Ｒ4group;*P＜0.05vsH8/Ｒ4group;☆P＜0.05vsPUEgroup．图2H/Ｒ与PUE预处理各组eNOS蛋白表达3PUE预处理增加cNOS活性如图3所示，与control组相比较，随着缺氧时间延长，H/Ｒ各组细胞cNOS活性逐渐降低(P＜0.05)，与同时点H/Ｒ组比较，应用PUE预处理后各组cNOS活性明显增加(P＜0.05)。Figure3．ThechangesofcNOSactivityineachgroup．Mean±SD．n=3．▲P＜0.05vscontrolgroup;#P＜0.05vsH2/Ｒ4group;△P＜0.05vsH4/Ｒ4group;*P＜0.05vsH8/Ｒ4group;☆P＜0.05vsPUEgroup．图3各组cNOS活性的变化4PUE预处理减少HUVECs细胞凋亡Control组及PUE组细胞生长良好，仅偶见细胞凋亡发生。H4/Ｒ4组细胞凋亡指数明显高于control组(P＜0.01);经PUE预处理后，细胞凋亡指数明显降低(P＜0.01)，见图4、5。Figure4．TheapoptosisofHUVECs(TUNEL，×200)．A:negativecontrolgroup;B:controlgroup;C:H4/Ｒ4group;D:PUEgroup;E:PUE+H4/Ｒ4group．图4HUVECs细胞凋亡情况5UO126及LY294002抑制PUE预处理上调的eNOS蛋白表达如图6所示，与control组相比，H4/Ｒ4组eNOS蛋白表达水平降低(P＜0.05)，单纯PUE预处理组和PUE+H4/Ｒ4组eNOS蛋白表达水平显著增加(P＜0.05);与H4/Ｒ4组相比，PUE组和PUE+H4/Ｒ4组eNOS蛋白表达水平明显增加(P＜0.05);与单纯PUE预处理组比较，U0126+PUE+H4/Ｒ4组、U0126+PUE组、LY294002+PUE+H4/Ｒ4组和LY294002+PUE组eNOS蛋白表达水平降低(P＜·860·
?和LY294002+PUE组eNOS蛋白表达水平降低(P＜0.05);与control组相比，U0126组、LY294002组和DMSO组eNOS蛋白表达水平的差异无统计学显著性。讨论当IＲI发生时，血管内皮细胞的功能异常发生时间早于实质细胞的损伤，且内皮细胞受损可引起血栓和粥样斑块形成、血管痉挛，进一步使实质细胞的Figure6．U0126andLY294002inhibitedtheproteinexpressionofeNOSup-regulatedbyPUEpretreatment．Mean±SD．n=9．▲P＜0.05vscontrolgroup;△P＜0.05vsH4/Ｒ4group;#P＜0.05vsPUEgroup;*P＜0.05vsPUE+H4/Ｒ4group．图6U0126及LY294002抑制PUE预处理上调的eNOS蛋白表达损伤加剧，因此有效保护血管内皮细胞是预防和治疗IＲI损伤的关键。本实验使用的HUVECs经鉴定为高纯度内皮细胞，因此可用于模拟血管内皮在H/Ｒ损伤时结构和功能的改变。正常情况下，血管内皮细胞可以通过eNOS分泌适量的NO来维持细胞正常氧化还原自稳态。然而在H/Ｒ后，内皮细胞可迅速生成大量的氧自由基，如超氧阴离子(O－·2)、羟自由基(OH－)等。有研究证实氧自由基可下调eNOS的mＲNA和eNOS蛋白表达［6］，我们也观察到内皮细胞在不同时点H/Ｒ后eNOS蛋白表达降低。本研究还测定了H/Ｒ后NOS活性，结果发现cNOS活性逐渐降低。cNOS包括了eNOS和神经元型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase，nNOS)，因此cNOS活性应为两者活性之和。nNOS主要表达于神经细胞中，本实验过程中通过Westernblot方法检测了各组内皮细胞中nNOS蛋白表达，但未测出，且本课题组前期研究中使用免疫组化的方法也发现nNOS在血管内皮细胞中表达水平很低［7］，故本实验中测定的cNOS活性主要为eNOS活性，可见H/Ｒ后eNOS活性是明显降低的。PUE是从豆科植物葛根提取
【参考文献】：
期刊论文
[1]依普利酮对高盐诱导的高血压大鼠主动脉内皮型一氧化氮合酶表达及活性的影响[J]. 张倩,丁菁,杨飞,王胜男,粟凤,陆德琴. 中国病理生理杂志. 2015(09)
[2]葛根素通过ERK1/2信号通路促进内皮细胞增殖[J]. 唐哲明,梁国荣. 四川生理科学杂志. 2012(02)
[3]葛根素治疗相关疾病的研究[J]. 韩春妍. 实用药物与临床. 2012(03)
[4]葛根素对过氧化氢诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用[J]. 高培国,强辉,凌鸣. 西安交通大学学报(医学版). 2012(02)
[5]葛根素通过PI3K/Akt途径对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的抑制[J]. 马亚飞,刘新伟,乔欣,王群英,杨海燕. 中国老年学杂志. 2010(08)
[6]葛根素对心肌细胞一氧化氮影响的研究[J]. 温葭,陈士林,Filly Cheung,郝雪娜. 中国心血管病研究杂志. 2006(10)
[7]葛根素对血管内皮细胞DNA损伤的保护作用[J]. 王春玲,傅攀峰,李宏伟,张静,修瑞娟. 中国微循环. 2004(06)
[8]缺氧与复氧对脑动脉内皮细胞一氧化氮合酶Ⅲ表达的影响[J]. 宋振举,杨光田,陆德琴,王迪浔. 中国危重病急救医学. 2003(09)
[9]NO在血管内皮细胞损伤中的标志作用[J]. 杨春华,林水金,杨映波,冯素珍. 急诊医学. 1999(03)
[10]卡托普利晚期预处理对人内皮细胞缺氧复氧损伤保护作用机制的研究[J]. 徐慧,文薏,谭虹. 中国心血管病研究杂志. 2013 (04)
硕士论文
[1]葛根素调节支架内狭窄炎症反应的机制研究[D]. 刘青.北京中医药大学 2007
本文编号：3413952
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