卡介苗热休克蛋白16.3基因突变株对小鼠巨噬细胞RAW 264.7自噬的影响

发布时间：2021-10-25 21:20

　　目的构建及鉴定卡介苗（BCG）和毒株H37Rv Hsp16.3基因突变株,观察该突变株对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响,为研究结核分枝杆菌潜伏感染形成的机制提供一定的理论依据。方法分别培养BCG和毒株H37Rv,提取BCG和毒株H37Rv的基因组DNA。设计两对引物,分别以BCG基因组/毒株H37Rv的基因组为模板,通过聚合酶链反应（PCR）的方法扩增出分子量为435 bp的Hsp16.3基因以及该基因两侧分子量分别为663 bp和684 bp的两个DNA片段,后分别插入到p KO载体上相应的位点,通过硫酸卡那霉素筛选,利用PCR扩增,双酶切以及测序的方法,筛选出阳性重组质粒p KO-Hsp16.3;根据同源重组的原理,应用电转化的方法,将阳性重组质粒p KO-Hsp16.3电转入BCG和毒株H37Rv的感受态细胞中,经过硫酸卡那霉素和蔗糖两次筛选,得到BCG和毒株H37Rv Hsp16.3基因突变株。绘制细菌OD值与菌落形成单位（CFU）相关性曲线,并根据培养细菌浓度确定感染菌落数。将筛选培养的BCG Hsp16.3突变株用于小鼠巨噬细胞的感染实验,并通过Western Blot和细胞免... 

【文章来源】：成都医学院四川省

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 卡介苗和毒株H37RV的HSP16.3 基因突变株的构建与鉴定
    1 实验材料
        1.1 主要实验仪器与耗材
        1.2 主要试剂
        1.3 主要溶液的配置
    2 实验方法
        2.1 HSP16.3 基因，HSP16.3 基因的 5' 端和的 3' 端基因的聚合酶链式反应
        2.2 引物的设计和合成
        2.3 通过PCR技术扩增出HSP16.3 基因及HSP16.3 基因 5' 端和 3' 端序列
        2.4 重组质粒 18T-HSP16.3-5' 和 18T-HSP16.3-3' 的构建与鉴定
        2.5 重组质粒PKO-HSP16.3-5' 的构建和鉴定
        2.6 重组质粒PKO-HSP16.3 的构建和鉴定
        2.7 重组质粒 pKO-Hsp16.3 的测序
        2.8 BCG和毒株H37RV HSP16.3 基因突变株的构建
        2.9 BCG和毒株H37RV HSP16.3 基因突变株的鉴定
        2.10 正常BCG和毒株H37RV与BCG和H37RV的HSP16.3 基因突变株的形态
    3 结果
        3.1 HSP16.3 基因的PCR扩增产物
        3.2 HSP16.3 基因 5' 端和 3' 端目的片段的PCR扩增产物
        3.3 重组质粒 18T-HSP16.3-5' 和 18T-HSP16.3-3' 的双酶切鉴定结果
        3.4 重组质粒 18T-HSP16.3-5' 和 18T-HSP16.3-3' 的测序结果
        3.5 重组质粒PKO-HSP16.3-5' 的双酶切鉴定结果
        3.6 重组质粒PKO-HSP16.3/PST I+HIND III的双酶切鉴定结果
        3.7 重组质粒PKO-HSP16.3 HSP16.3 基因的 5' 端和 3' 端目的片段的PCR鉴定结果
        3.8 重组质粒PKO-HSP16.3 中HSP16.3 基因的 5' 端和 3' 端基因序列的测序结果
        3.9 BCG和毒株H37RV HSP16.3 基因突变株经硫酸卡那霉素筛选结果
        3.10 BCG 和毒株 H37Rv Hsp16.3 基因突变株的 Kana 基因菌液 PCR筛选结果
        3.11 BCG和H37RV HSP16.3 基因突变株培养液PCR筛选结果
        3.12 结核分枝杆菌抗酸染色结果
    4 讨论
第二部分BCG HSP16.3 基因突变株对小鼠巨噬细胞RAW264.7 自噬功能的影响
    1 实验材料
        1.1 主要实验仪器与耗材
        1.2 主要试剂
        1.3 主要溶液的配制
    2 方法
        2.1 HSP16.3 基因突变株CFU计数
        2.2 小鼠巨噬细胞RAW 264.7 的传代、冻存及复苏
        2.3 HSP16.3 基因突变株对小鼠巨噬细胞RAW 264.7 自噬功能的影响
        2.4 BCG HSP16.3 基因突变株对小鼠巨噬细胞RAW 264.7 自噬影响的共聚焦检测
    3 结果
        3.1 BCG HSP16.3 基因突变株CFU计数结果
        3.2 雷帕霉素在24H内诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7 发生自噬的WESTERN BLOT结果
        3.3 3-MA对雷帕霉素诱导自噬发生的最适抑制浓度
        3.4 BCG HSP16.3 基因突变株对小鼠巨噬细胞RAW 264.7 自噬影响的WESTERNBLOT结果
        3.5 BCG HSP16.3 基因突变株影响小鼠巨噬细胞RAW 264.7 自噬功能的激光共聚焦结果
    4 讨论
    5 小结
参考文献
文献综述
    参考文献
附录一
附录二
攻读硕士学位期间研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]吸光度法快速确定菌悬液浓度及其适用范围[J]. 马秀玲,陈蕊君,王飞,徐腾月.  微生物学杂志. 2014(04)
[2]雷帕霉素对再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞生物学功能的影响[J]. 王昕,马凤霞,卢士红,池颖,陈芳,李雪,李娟娟,杜文静,冯影,崔俊杰,宋保全,韩忠朝.  中国实验血液学杂志. 2014(03)
[3]结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16.3蛋白的原核表达及功能检测[J]. 秦欢,高绍莹,袁建波,徐林,罗军敏.  细胞与分子免疫学杂志. 2014(05)
[4]卡介苗菌MDP1基因敲除技术的研究[J]. 陈效友,李传友,马玙,刘冲,王敬慧,张雪峰,昌增益.  中华结核和呼吸杂志. 2004(03)



本文编号：3458184