泛素蛋白酶体途径在猪圆环病毒2型体外感染中的作用研究
发布时间：2024-03-19 19:22
猪圆环病毒2型(PCV2),一种单股环状DNA病毒,是引起猪圆环病毒相关疾病的重要病原之一。PCV2的主要靶细胞是单核巨噬细胞系统,其所引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征以淋巴细胞衰竭、炎性细胞浸润为特征,造成机体的免疫功能抑制,继而易引起其他细菌和病毒等病原体的继发感染,给世界养猪业带来了巨大的经济损失。 泛素蛋白酶体途径是调节真核细胞内蛋白质水平的重要途径之一,除了降解细胞内大量蛋白质外,其还参与调节细胞凋亡和分化、细胞周期进程、信号转导通路、炎性反应、蛋白质合成等。鉴于泛素蛋白酶体途径在细胞内重要的生理学意义,很多病毒利用其来满足自身需要,如病毒复制(包括病毒吸附、转录、翻译、组装和释放)、病毒的免疫逃逸、癌症进程、疾病过程等。目前PCV2感染和泛素蛋白酶体途径的相互作用尚未见报道。 本研究首先验证了感染PCV2的猪肺泡巨噬细胞差异蛋白质的表达,然后从泛素蛋白酶体途径着手,分析了泛素蛋白酶体途径对PCV2复制的影响,以及泛素蛋白酶体途径相关的差异蛋白质(PSME1和PSMB2)在PCV2致病机理中的作用。具体研究内容如下： 1.蛋白质组学分析感染PCV2的猪肺泡巨噬细胞差异蛋白质的验...
【文章页数】：128 页
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第1章 文献综述
1.1 猪圆环病毒概述
1.1.1 PCV1
1.1.2 PCV2
1.1.3 PCV生物学特性
1.2 PCV2基因组成
1.2.1 PCV2基因结构
1.2.2 PCV2蛋白质功能
1.3 病毒复制
1.3.1 复制因子
1.3.1.1 先导链复制原点
1.3.1.2 REP复合物
1.4 PCV2起源与演化
1.5 PCV2的传播途径
1.6 PCV2感染与临床疾病
1.6.1 猪圆环病毒相关疾病
1.6.1.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征
1.6.1.2 猪皮炎肾病综合征
1.6.1.3 猪呼吸道疾病综合征
1.6.1.4 繁殖障碍
1.6.1.5 肉芽肿性肠炎
1.6.1.6 渗出性皮炎
1.6.1.7 坏死性淋巴结炎
1.6.1.8 先天性震颤
1.6.2 与其他病原混合感染
1.7 PCV2致病机理
1.7.1 PCV2复制机理
1.7.2 淋巴细胞衰竭和免疫抑制
1.7.2.1 PCV2感染和凋亡
1.7.2.2 PCV2毒力的基因决定性
1.7.2.3 免疫增强诱发PCVAD
1.7.3 与宿主免疫系统的相互作用
1.7.3.1 感染免疫细胞
1.7.3.2 IL-10和其他细胞因子在PCV2感染中的作用
1.7.3.3 病毒与宿主蛋白的相互作用
1.7.3.4 病毒DNA与宿主蛋白的相互作用
1.8 PCV2诊断
1.9 PCV2疫苗研究进展
1.10 泛素蛋白酶体途径概述
1.11 泛素蛋白酶体的组成元件
1.11.1 泛素
1.11.2 泛素蛋白酶体途径相关的酶
1.11.2.1 E1激活酶
1.11.2.2 E2结合酶
1.11.2.3 E3连接酶
1.11.2.4 解离酶
1.11.3 蛋白酶体
1.11.3.1 蛋白酶体的结构与作用机制
1.11.3.2 蛋白酶体的细胞定位
1.11.4 蛋白酶体激活物
1.11.4.1 PA700
1.11.4.2 PA28
1.11.4.3 PA200
1.11.5 蛋白酶体抑制剂
1.11.5.1 化学合成的蛋白酶体抑制剂
1.11.5.2 天然蛋白酶抑制剂
1.11.6 靶蛋白泛素化和降解信号
1.12 泛素蛋白酶体途径的功能
1.12.1 调节细胞周期
1.12.2 癌症和细胞存活
1.12.3 炎性应答
1.12.4 免疫应答
1.12.5 蛋白的错误折叠
1.12.6 内质网相关的降解
1.12.7 疾病进程
第2章 研究目的与意义
第3章 实验材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 细胞、毒株与菌株
3.1.2 载体与质粒
3.1.3 主要培养基和溶液的配制
3.1.4 主要试剂与试剂盒
3.1.5 主要缓冲液与相关试剂的配制
3.1.6 主要实验器材
3.2 实验方法
3.2.1 PCV2增殖
3.2.2 细胞活力的测定
3.2.3 病毒感染
3.2.4 病毒DNA提取
3.2.5 分子克隆技术
3.2.5.1 PCR扩增
3.2.5.2 PCR产物或酶切反应的电泳检测
3.2.5.3 PCR产物或酶切产物的回收
3.2.5.4 DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.5.5 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
3.2.5.6 连接产物的转化
3.2.5.7 质粒的制备与鉴定
3.2.5.8 质粒的大量制备
3.2.5.9 质粒DNA浓度的测定
3.2.6 RNA提取
3.2.6.1 细胞总RNA的提取
3.2.6.2 DNase Ⅰ处理
3.2.6.3 cDNA合成
3.2.7 实时绝对荧光定量PCR
3.2.7.1 标准质粒的制备
3.2.7.2 绝对荧光定量PCR
3.2.8 实时相对荧光定量PCR
3.2.9 转染
3.2.10 目的蛋白在真核细胞中表达的检测(Western blot方法)
3.2.10.1 细胞总蛋白的提取
3.2.10.2 细胞核蛋白的提取
3.2.10.3 SDS-PAGE电泳
3.2.10.4 Western blot
3.2.11 流式细胞术分析细胞周期和Sub-G1
3.2.12 蛋白酶体活性的测定
3.2.13 NF-κB荧光素酶活性检测
3.2.14 间接免疫荧光
3.2.15 共聚焦技术
3.2.16 荧光蛋白标记的共定位
3.2.17 统计学方法
第4章 实验结果与分析
4.1 感染PCV2猪肺泡巨噬细胞蛋白质组学差异蛋白的验证
4.1.1 PCV2感染及病毒滴度的测定
4.1.2 差异蛋白的动态学变化
4.1.3 差异蛋白的相对定量验证
4.1.4 差异蛋白的Western blot验证
4.1.5 差异蛋白β-tubulin与PCV2 ORF2共定位分析
4.2 泛素蛋白酶体途径对PCV2复制的影响
4.2.1 细胞活力的测定
4.2.2 蛋白酶体抑制剂影响PCV2复制
4.2.3 蛋白酶体抑制剂对PCV2不同复制阶段的影响
4.3 蛋白酶体抑制剂对细胞周期的影响
4.4 PCV2感染对泛素蛋白酶体途径的影响
4.4.1 PCV2感染促进细胞内蛋白质的泛素化
4.4.2 PCV2感染对蛋白酶体糜蛋白酶样活性的影响
4.5 针对泛素的siRNA降低PCV2增殖滴度
4.6 泛素蛋白酶体途径相关蛋白(PSME1和PSMB2)与PCV2的相互作用
4.6.1 构建真核质粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2
4.6.1.1 基因PSME1和PSMB2的扩增
4.6.1.2 真核质粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2的构建
4.6.1.3 真核质粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2的鉴定
4.6.2 真核质粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2对PCV2复制的影响
4.6.2.1 真核质粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2对PCV2滴度的影响
4.6.2.2 真核质粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2促进ORF2的表达
4.6.3 真核质粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2对NF-κB信号通路的作用
4.6.3.1 pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2对NF-κB荧光素酶活性的影响
4.6.3.2 pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2诱导IκBα的降解和p65的核转位
4.6.3.3 真核质粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2对炎性因子的影响
4.6.4 NF-κB信号通路抑制剂BAY对PSMB2增强病毒滴度的影响
4.6.4.1 BAY对细胞活力的影响
4.6.4.2 BAY对转染PSMB2 PK15细胞中PCV2滴度的影响
4.7 PSME1、PSMB2与ORF2、ORF3的共定位
4.7.1 荧光质粒pEGFP-ORF2、pEGFP-ORF3和DsRed-PSME1、DsRed-PSMB2的扩增
4.7.2 重组质粒pEGFP-ORF2、ORF3和DsRed-PSME1、PSMB2的构建
4.7.3 荧光质粒DsRed-PSME1、PSMB2和pEGFP-ORF2、ORF3的鉴定
4.7.4 荧光质粒pEGFP-ORF2、pEGFP-ORF3和DsRed-PSME1、DsRed-PSMB2的共定位
第5章 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 PCV2感染引起猪肺泡巨噬细胞功能变化
5.1.2 泛素蛋白酶体途径是PCV2早期有效复制所必需的
5.1.2.1 抑制泛素蛋白酶体途径降低PCV2滴度
5.1.2.2 蛋白酶体抑制剂降低PCV2转录和翻译
5.1.3 泛素蛋白酶体途径调节细胞周期进程
5.1.4 PCV2感染与细胞内蛋白质泛素化相关
5.1.5 PSME1调节细胞内炎性因子
5.1.6 PSMB2经由NF-κB信号通路促进PCV2增殖
5.1.7 泛素蛋白酶体途径和猪圆环病毒相关疾病
5.2 结论
参考文献
附录
致谢
本文编号：3932516
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摘要
Abstract
缩略语表
第1章 文献综述
1.1 猪圆环病毒概述
1.1.1 PCV1
1.1.2 PCV2
1.1.3 PCV生物学特性
1.2 PCV2基因组成
1.2.1 PCV2基因结构
1.2.2 PCV2蛋白质功能
1.3 病毒复制
1.3.1 复制因子
1.3.1.1 先导链复制原点
1.3.1.2 REP复合物
1.4 PCV2起源与演化
1.5 PCV2的传播途径
1.6 PCV2感染与临床疾病
1.6.1 猪圆环病毒相关疾病
1.6.1.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征
1.6.1.2 猪皮炎肾病综合征
1.6.1.3 猪呼吸道疾病综合征
1.6.1.4 繁殖障碍
1.6.1.5 肉芽肿性肠炎
1.6.1.6 渗出性皮炎
1.6.1.7 坏死性淋巴结炎
1.6.1.8 先天性震颤
1.6.2 与其他病原混合感染
1.7 PCV2致病机理
1.7.1 PCV2复制机理
1.7.2 淋巴细胞衰竭和免疫抑制
1.7.2.1 PCV2感染和凋亡
1.7.2.2 PCV2毒力的基因决定性
1.7.2.3 免疫增强诱发PCVAD
1.7.3 与宿主免疫系统的相互作用
1.7.3.1 感染免疫细胞
1.7.3.2 IL-10和其他细胞因子在PCV2感染中的作用
1.7.3.3 病毒与宿主蛋白的相互作用
1.7.3.4 病毒DNA与宿主蛋白的相互作用
1.8 PCV2诊断
1.9 PCV2疫苗研究进展
1.10 泛素蛋白酶体途径概述
1.11 泛素蛋白酶体的组成元件
1.11.1 泛素
1.11.2 泛素蛋白酶体途径相关的酶
1.11.2.1 E1激活酶
1.11.2.2 E2结合酶
1.11.2.3 E3连接酶
1.11.2.4 解离酶
1.11.3 蛋白酶体
1.11.3.1 蛋白酶体的结构与作用机制
1.11.3.2 蛋白酶体的细胞定位
1.11.4 蛋白酶体激活物
1.11.4.1 PA700
1.11.4.2 PA28
1.11.4.3 PA200
1.11.5 蛋白酶体抑制剂
1.11.5.1 化学合成的蛋白酶体抑制剂
1.11.5.2 天然蛋白酶抑制剂
1.11.6 靶蛋白泛素化和降解信号
1.12 泛素蛋白酶体途径的功能
1.12.1 调节细胞周期
1.12.2 癌症和细胞存活
1.12.3 炎性应答
1.12.4 免疫应答
1.12.5 蛋白的错误折叠
1.12.6 内质网相关的降解
1.12.7 疾病进程
第2章 研究目的与意义
第3章 实验材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 细胞、毒株与菌株
3.1.2 载体与质粒
3.1.3 主要培养基和溶液的配制
3.1.4 主要试剂与试剂盒
3.1.5 主要缓冲液与相关试剂的配制
3.1.6 主要实验器材
3.2 实验方法
3.2.1 PCV2增殖
3.2.2 细胞活力的测定
3.2.3 病毒感染
3.2.4 病毒DNA提取
3.2.5 分子克隆技术
3.2.5.1 PCR扩增
3.2.5.2 PCR产物或酶切反应的电泳检测
3.2.5.3 PCR产物或酶切产物的回收
3.2.5.4 DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.5.5 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
3.2.5.6 连接产物的转化
3.2.5.7 质粒的制备与鉴定
3.2.5.8 质粒的大量制备
3.2.5.9 质粒DNA浓度的测定
3.2.6 RNA提取
3.2.6.1 细胞总RNA的提取
3.2.6.2 DNase Ⅰ处理
3.2.6.3 cDNA合成
3.2.7 实时绝对荧光定量PCR
3.2.7.1 标准质粒的制备
3.2.7.2 绝对荧光定量PCR
3.2.8 实时相对荧光定量PCR
3.2.9 转染
3.2.10 目的蛋白在真核细胞中表达的检测(Western blot方法)
3.2.10.1 细胞总蛋白的提取
3.2.10.2 细胞核蛋白的提取
3.2.10.3 SDS-PAGE电泳
3.2.10.4 Western blot
3.2.11 流式细胞术分析细胞周期和Sub-G1
3.2.12 蛋白酶体活性的测定
3.2.13 NF-κB荧光素酶活性检测
3.2.14 间接免疫荧光
3.2.15 共聚焦技术
3.2.16 荧光蛋白标记的共定位
3.2.17 统计学方法
第4章 实验结果与分析
4.1 感染PCV2猪肺泡巨噬细胞蛋白质组学差异蛋白的验证
4.1.1 PCV2感染及病毒滴度的测定
4.1.2 差异蛋白的动态学变化
4.1.3 差异蛋白的相对定量验证
4.1.4 差异蛋白的Western blot验证
4.1.5 差异蛋白β-tubulin与PCV2 ORF2共定位分析
4.2 泛素蛋白酶体途径对PCV2复制的影响
4.2.1 细胞活力的测定
4.2.2 蛋白酶体抑制剂影响PCV2复制
4.2.3 蛋白酶体抑制剂对PCV2不同复制阶段的影响
4.3 蛋白酶体抑制剂对细胞周期的影响
4.4 PCV2感染对泛素蛋白酶体途径的影响
4.4.1 PCV2感染促进细胞内蛋白质的泛素化
4.4.2 PCV2感染对蛋白酶体糜蛋白酶样活性的影响
4.5 针对泛素的siRNA降低PCV2增殖滴度
4.6 泛素蛋白酶体途径相关蛋白(PSME1和PSMB2)与PCV2的相互作用
4.6.1 构建真核质粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2
4.6.1.1 基因PSME1和PSMB2的扩增
4.6.1.2 真核质粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2的构建
4.6.1.3 真核质粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2的鉴定
4.6.2 真核质粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2对PCV2复制的影响
4.6.2.1 真核质粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2对PCV2滴度的影响
4.6.2.2 真核质粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2促进ORF2的表达
4.6.3 真核质粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2对NF-κB信号通路的作用
4.6.3.1 pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2对NF-κB荧光素酶活性的影响
4.6.3.2 pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2诱导IκBα的降解和p65的核转位
4.6.3.3 真核质粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2对炎性因子的影响
4.6.4 NF-κB信号通路抑制剂BAY对PSMB2增强病毒滴度的影响
4.6.4.1 BAY对细胞活力的影响
4.6.4.2 BAY对转染PSMB2 PK15细胞中PCV2滴度的影响
4.7 PSME1、PSMB2与ORF2、ORF3的共定位
4.7.1 荧光质粒pEGFP-ORF2、pEGFP-ORF3和DsRed-PSME1、DsRed-PSMB2的扩增
4.7.2 重组质粒pEGFP-ORF2、ORF3和DsRed-PSME1、PSMB2的构建
4.7.3 荧光质粒DsRed-PSME1、PSMB2和pEGFP-ORF2、ORF3的鉴定
4.7.4 荧光质粒pEGFP-ORF2、pEGFP-ORF3和DsRed-PSME1、DsRed-PSMB2的共定位
第5章 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 PCV2感染引起猪肺泡巨噬细胞功能变化
5.1.2 泛素蛋白酶体途径是PCV2早期有效复制所必需的
5.1.2.1 抑制泛素蛋白酶体途径降低PCV2滴度
5.1.2.2 蛋白酶体抑制剂降低PCV2转录和翻译
5.1.3 泛素蛋白酶体途径调节细胞周期进程
5.1.4 PCV2感染与细胞内蛋白质泛素化相关
5.1.5 PSME1调节细胞内炎性因子
5.1.6 PSMB2经由NF-κB信号通路促进PCV2增殖
5.1.7 泛素蛋白酶体途径和猪圆环病毒相关疾病
5.2 结论
参考文献
附录
致谢
本文编号：3932516
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