Polycystin 2-Scribble-YAP通路在常染色体显性多囊肾病囊肿形成中的作用研究

发布时间：2020-11-15 12:29

　　研究背景及目的:常染色体显性多囊肾病(autosomal-dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是最为常见的遗传性致死性肾脏囊肿性疾病,由PKD1和PKD2基因发生突变导致。PKD1编码多囊蛋白1(polycystin 1,PC1);PKD2编码多囊蛋白2(polycystin 2,PC2)。PC1和PC2可定位于细胞的多种膜结构上,如:细胞顶端膜的初级纤毛,内质网高尔基体膜和细胞基底侧膜等,并对维持细胞膜正常生理功能至关重要。顶端基底细胞极性紊乱在ADPKD患者肾组织中十分常见,且与肾囊肿发生发展密切相关。顶端基底细胞极性的正常建立主要依赖于三种核心蛋白复合体:PAR复合体、Crumbs复合体和Scribble复合体。其中Scribble复合体包含Scribble、DLG和LGL等蛋白,在建立和维持细胞基底侧面极性方面发挥重要作用。Scribble蛋白的N端含有16个富含亮氨酸的重复片段(leucine-rich repeats,LRR)结构域,而在其C末端则含有4个PDZ(PSD95/DLG/ZO-1)结构域,这些结构域与Scribble蛋白生物学功能密切相关。研究表明,敲低斑马鱼scrib基因表达可导致其产生前肾囊肿表型,提示Scribble蛋白在调控肾囊肿形成方面具有重要作用,但其在ADPKD肾囊肿发生发展中的作用尚不明确。近期研究发现,Scribble可以通过活化Hippo通路上游LATS1/2激酶来影响YAP蛋白的磷酸化水平,从而调控YAP蛋白亚细胞定位。而在ADPKD患者肾组织中,Hippo通路活性受到抑制,降低了YAP蛋白的磷酸化水平,从而促使YAP蛋白由细胞质中转移到细胞核内。研究表明,YAP蛋白在细胞核内聚集与肿瘤进展相关,但也有研究指出,细胞质中YAP可通过调控Wnt/β-catenin通路来抑制肿瘤细胞增殖。因此,探究细胞质YAP和细胞核YAP在ADPKD肾囊肿形成中的作用具有重要意义。本研究拟探究Scribble和细胞质YAP在肾囊肿形成中的重要作用,并阐明Scribble通过调控YAP蛋白亚细胞定位来影响ADPKD肾囊肿发生发展的具体机制。研究方法:(1)利用蛋白免疫印迹、免疫荧光和RT-PCR技术,分别检测ADPKD斑马鱼模型(pkd2 morphants)和细胞模型(小鼠Pkd2~(-/-)细胞系)中Scribble的表达及定位情况;通过显微注射技术探究Scribble蛋白及其不同结构域(Scribble-LRR和Scribble-PDZ)对pkd2 morphants前肾囊肿形成的调控作用。(2)利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼scrib突变体,观察突变体鱼是否存在多囊肾相关表型。(3)通过蛋白免疫印迹、免疫荧光和RT-PCR技术分别检测Hippo通路分子(pLATS1、LATS1、pYAP和YAP)在斑马鱼scrib突变体和敲低Scribble的人肾小管上皮细胞中的表达情况。(4)利用蛋白免疫印迹、免疫荧光和RT-PCR技术,分别检测pLATS1、LATS1、pYAP以及YAP在pkd2 morphants和Pkd2~(-/-)细胞系中的表达及定位情况;构建Tg(Tolcdh17:yap-gfp)、Tg(Tolcdh17:yapS87A-gfp)和Tg(Tolcdh17:yapS87D-gfp)转基因鱼,观察不同类型YAP蛋白(YAP、YAPS87A和YAPS87D)在斑马鱼前肾管上皮细胞中的定位情况;在pkd2 morphants中显微注射过表达不同类型YAP蛋白,观察其对pkd2 morphants前肾囊肿形成的影响;给予pkd2 morphants Verteprofin药物干预,观察拮抗YAP蛋白进入细胞核后效应对pkd2 morphants前肾囊肿形成的影响。(5)构建斑马鱼lats1突变体和yap突变体,观察突变体鱼是否存在前肾囊肿表型。(6)在Pkd2~(-/-)细胞系中过表达Scribble腺病毒,观察Scribble可否在ADPKD疾病背景下调控pLATS1、LATS1、pYAP和YAP蛋白表达;在HEK293T细胞中分别过表达Scribble、Scribble-LRR和Scribble-PDZ,明确Scribble是通过哪一结构域来调控YAP蛋白的细胞亚定位;利用morpholino技术构建scrib morphants,并在scrib morphants中过表达不同类型YAP蛋白(YAP、YAPS87A和YAPS87D),观察其对scrib morphants前肾囊肿形成的影响。结果:(1)Scribble在pkd2 morphants和Pkd2~(-/-)细胞中表达下调。(2)免疫荧光检查发现Scribble定位于斑马鱼前肾管上皮细胞的基底侧膜上,且Scribble可与PC2在细胞膜上共定位。(3)过表达Scribble和Scribble-PDZ可抑制pkd2 morphants前肾囊肿形成,而过表达Scribble-LRR不具有类似效应。(4)斑马鱼scrib突变体具有前肾管增粗表型,而敲除scrib可促使pkd2 morphants前肾囊肿表型加重。(5)pLATS1和pYAP水平在scrib突变体和敲低Scribble的人肾小管上皮细胞中表达下调,且免疫荧光染色发现YAP蛋白在scrib突变体前肾管上皮细胞中由细胞质中转移到细胞核内。(6)pLATS1和pYAP水平在pkd2 morphants和Pkd2~(-/-)细胞中表达下调;免疫荧光检测发现,在pkd2 morphants前肾管上皮细胞和Pkd2~(-/-)细胞中,细胞质中YAP蛋白减少,细胞核内YAP增多。(7)免疫荧光染色发现,YAP和YAPS87D蛋白定位于转基因鱼前肾管上皮细胞的细胞质中,而YAPS87A定位于细胞核内。(8)过表达YAP和YAPS87D可抑制pkd2 morphants前肾囊肿形成,而过表达YAPS87A不具有类似效应;当给予pkd2 morphants Verteprofin药物处理时,其多囊肾相关表型不能得到有效缓解。(9)斑马鱼lats1突变体不具有多囊肾相关表型,但敲除lats1可促使pkd2 morphants前肾囊肿表型加重。(10)斑马鱼yap突变体具有前肾囊肿表型;过表达YAP和YAPS87D可抑制yap突变体前肾囊肿形成,而过表达YAPS87A不具有类似效应。(11)在Pkd2~(-/-)细胞中过表达Scribble可有效提升pLATS1和pYAP表达水平。(12)过表达Scribble和Scribble-PDZ可提升pYAP表达水平,促使YAP蛋白从细胞核内转移到细胞质中,而过表达Scribble-LRR不具有类似效应。(13)scrib morphants具有前肾囊肿表型;过表达YAP和YAPS87D可抑制scrib morphants前肾囊肿形成,而过表达YAPS87A可促进scrib morphants前肾囊肿形成。结论:(1)Scribble和细胞质YAP在ADPKD肾囊肿发生发展中发挥重要调控作用;(2)Scribble和细胞质YAP对斑马鱼前肾管发育以及前肾囊肿形成至关重要;(3)Scribble可通过调控YAP蛋白亚细胞定位来影响ADPKD肾囊肿的发生发展。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R692
【部分图文】：

细胞系,基底细胞,极性,蛋白

三、实验结果（一）顶端基底细胞极性蛋白相关基因在 Pkd2-/-细胞系中表达情况维持细胞正常顶端基底极性需要三大类蛋白复合体，其中包括 PAR 复合体（包括 PAR3，PAR6 和 CDC42 等），Crumbs 复合体（包括 Crumb3，PATJ 和 PLAS1 等）和 Scribble 复合体（包括 Scribble，DLG1 和 LGL1 等）。为探究这些细胞极性蛋白在ADPKD 中的表达情况，我们利用 RT-PCR 技术在小鼠 Pkd2-/-细胞系中检测了这些极性蛋白 mRNA 水平的表达变化。检测发现，与 Pkd2+/-细胞相比，Pkd2-/-细胞的 Pkd2mRNA 水平存在明显下调，而编码细胞极性蛋白的 Crumb3、Par6a、Par6b、Scrib、Lgl1 和 Dlg1 基因的 mRNA 表达水平均存在差异性表达，其中，Par6b，Scrib 和 Lgl1等基因的 mRNA 水平存在明显的下调，而 Dlg1 基因的 mRNA 水平存在明显的上调，提示细胞极性蛋白在 ADPKD 中存在差异性表达（图 1-1）。

细胞系,小鼠,蛋白,免疫荧光技术

海军军医大学博士学位论文均存在差异性表达，提示 Scribble 复合体相关蛋白表达异常在 ADPKD 中尤为显著。Scribble 蛋白作为 Scribble 复合体的核心蛋白，其表达情况需在 ADPKD 动物和细胞模型中进一步探究。1、Scribble 蛋白在小鼠 Pkd2-/-细胞系中低表达我们利用蛋白免疫印迹技术检测了Pkd2+/-和Pkd2-/-细胞中Scribble蛋白的表达情况，发现 Scribble 在 Pkd2-/-细胞中存在显著的表达下调（图 1-2A, B）；为进一步验证Scribble 蛋白的表达情况，我们利用免疫荧光技术也发现，Scribble 在 Pkd2-/-细胞中的表达量要明显低于 Pkd2+/-细胞（图 1-2C）。

斑马鱼,蛋白,前肾管,侧膜

图 1-3：Scribble 蛋白在斑马鱼 pkd2 morphants 中低表达。综上，我们通过多种实验方法检测发现，Scribble 蛋白在 ADPKD 动物和细胞中低表达。（三）Scribble 蛋白定位既往研究发现，Scribble 蛋白主要定位于细胞膜的基底侧面上，为探究 Scrib白在斑马鱼前肾管上皮细胞中的定位情况，我们将细胞基底侧膜标记蛋白 Cdh Scribble 在斑马鱼的前肾管（Pronephric duct）和肠管（Gut）中共染，发现 Cd Scribble 在斑马鱼的前肾管和肠管上皮细胞中存在共定位现象，提示 Scribble 蛋要定位于斑马鱼前肾管和和肠管上皮细胞的基底侧膜上（图 1-4）。
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