京尼平交联兔脱细胞气管基质材料结构完整性、免疫原性及生物力学性能的实验研究

发布时间：2017-04-16 18:07

  本文关键词：京尼平交联兔脱细胞气管基质材料结构完整性、免疫原性及生物力学性能的实验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目前,脱细胞技术广泛应用于器官重建基质材料制备的研究。本文旨在通过去污剂-联合酶法(detrgent-enzymatic method, DEM)对新西兰兔气管实施脱细胞处理,研究经脱细胞处理后气管基质材料结构完整性、免疫原性及生物力学性能的变化；并通过对脱细胞气管基质材料进行京尼平交联,研究经交联后气管基质材料生物相容性、生物力学性能及血管再生性能的变化。本研究内容包括以下二部分：第一部分去污剂-联合酶法行兔脱细胞气管基质材料的制备及性能评价目的：研究兔气管支架最佳脱细胞周期,进行气管基质材料细胞外基质结构及生物力学性能评价。方法：选取50只健康新西兰兔,体质量2.5～3.0 kg,雌雄不限。随机数字表法分为10组(n=5),A组5只气管作为新鲜对照组,B、C、D, E、F、G、H、L J组对应脱细胞1、3、5、6、7、8、9周期组、异体移植组、异体移植对照组。通过去污剂-联合酶法(DEM)分别对气管进行周期脱细胞处理,通过HE染色、Movat五色染色、DAPI染色显微镜观察,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察,以及生物力学性能测定,遴选出最佳脱细胞周期。选取原生气管基质材料及最佳脱细胞周期气管基质材料,应用免疫组织化学法检测主要组织相容性复合体第二型(major histocompatibility complex class Ⅱ, MHC-Ⅱ)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的表达,番红O染色观察,糖胺聚糖(glycoasminoglycan, GAG)含量、细胞含量以及DNA含量检测。结果：与对照组相比,经7个DEM循环之后组织工程基质细胞核溶解、极少数细胞核残留,组织结构未见明显破坏；组织学与分子生物学分析显示,细胞成分及细胞核物质近乎全部去除；SEM显示脱细胞基质依然保持完整的结构体系：生物力学性能检测显示脱细胞并未对基质形态学及机械性能产生明显影响；免疫荧光分析显示脱细胞气管基质细胞核物质显著减少(P0.05)；DNA量化结果显示：脱细胞基质中DNA含量为(42.39±6.66)ng/mg,与原生组织(586.78± 53.56)ng/ml相比,减少92.78%(P0.01)。结论：通过7个周期DEM处理,能够有效获取长段低免疫原性兔脱细胞气管基质材料,具有与原生气管相似的结构特征及生物力学性能,是一种较为理想的气管基质支架材料。第二部分 京尼平交联对兔脱细胞气管基质材料生物力学性能及血管生成的影响目的：对经DEM法脱细胞处理的气管基质材料进行京尼平交联,研究京尼平对脱细胞气管基质生物力学性能及血管生成性能的影响。方法：采用去污剂-联合酶法(DEM)对新西兰兔气管行脱细胞处理,用京尼平交联,对交联后的基质材料行生物力学测试、鸡胚绒毛尿囊膜(chicken embryo chorioallantoic membrane, CAM)血管再生实验及气管基质材料异体移植实验研究。结果：与原生样本及脱细胞样本相比,1%京尼平交联脱细胞气管基质材料弹性模量明显增加(P0.05)；经1%京尼平交联脱细胞气管基质材料能够显著诱导血管生成；异体移植实验显示,1%京尼平交联脱细胞气管基质材料体内异体移植未见明显的炎症细胞浸润。结论：京尼平交联能够有效提高脱细胞气管基质生物力学性能,且不影响脱细胞气管基质血管生成性能,也不诱发体内炎性反应。
【关键词】：气管 脱细胞 细胞外基质 京尼平 血管生成 力学性能
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-11
• 符号说明11-12
• 引言12-14
• 第一部分 去污剂-联合酶法行兔脱细胞组织工程气管的制备及其性能评价14-26
• 1 材料15-16
• 1.1 主要仪器设备15
• 1.2 标本和主要试剂15-16
• 1.2.1 实验动物15-16
• 1.2.2 试剂耗材16
• 1.2.3 试剂盒16
• 2 方法16-20
• 2.1 主要试剂配制16-17
• 2.2 制备脱细胞气管支架17
• 2.3 组织病理学、免疫荧光学分析17
• 2.4 扫描电子显微镜观察17
• 2.5 冰冻切片免疫组织化学分析17-18
• 2.6 细胞含量测定18
• 2.7 糖胺聚糖(GAG)生物化学含量测定18-19
• 2.7.1 GAG提取18
• 2.7.2 GAG含量测定18-19
• 2.8 DNA量化19-20
• 2.9 生物力学测试20
• 2.10 气管基质异体移植20
• 2.11 统计学处理20
• 3 结果20-22
• 3.1 大体标本观察20
• 3.2 免疫荧光观察20
• 3.3 组织学观察20-21
• 3.4 扫描电镜观察21
• 3.5 免疫组化分析21
• 3.6 生物力学检测21
• 3.7 细胞含量及DNA含量分析21
• 3.8 GAG量化结果比较21
• 3.9 体内异体移植实验21-22
• 4 讨论22-24
• 参考文献24-26
• 第二部分 京尼平交联对兔脱细胞气管基质材料生物力学性能及血管生成的影响26-36
• 1 材料27-28
• 1.1 主要仪器设备27
• 1.2 标本和主要试剂27-28
• 1.2.1 实验动物27-28
• 1.2.2 试剂耗材28
• 1.2.3 试剂盒28
• 2 方法28-30
• 2.1 主要试剂配制28
• 2.2 制备脱细胞气管支架28-29
• 2.3 组织病理学、免疫荧光学分析29
• 2.4 京尼平处理29
• 2.5 扫描电子显微镜观察29
• 2.6 生物力学测试29-30
• 2.7 气管基质体内血管生成30
• 2.8 气管基质异体移植30
• 2.9 受体组织分析30
• 2.10 统计学处理30
• 3 结果30-31
• 3.1 脱细胞气管基质特征30-31
• 3.2 扫描电镜观察31
• 3.3 生物力学性能31
• 3.4. 体内血管再生性能观察31
• 3.5. 体内动物实验31
• 4 讨论31-33
• 参考文献33-36
• 附：相关图片36-49
• 全文总结49-50
• 特色与创新50-51
• 综述一 体内原位组织工程气管干细胞种植的研究现状与进展51-58
• 参考文献55-58
• 综述二 京尼平交联在胸心外科组织工程领域的应用与研究进展58-66
• 参考文献62-66
• 综述三 组织工程气管体内原位移植的研究进展66-74
• 参考文献70-74
• 综述四 组织工程气管细胞来源与应用的研究进展74-80
• 参考文献77-80
• Article Ⅰ Structural integrity, immunogenicity and biomechanical evaluation of rabbitdecelluarized tracheal matrix80-103
• References92-103
• 致谢103-104
• 攻读硕士学位期间科研成果104-106

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本文编号：311362