孤雌胚胎干细胞来源的组织工程皮肤种子细胞的研究

发布时间：2017-04-28 01:10

  本文关键词：孤雌胚胎干细胞来源的组织工程皮肤种子细胞的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：皮肤是人体最大的器官,在保持人体温度,抵御外界影响中发挥了重要的作用。创伤、感染、肿瘤切除等造成的皮肤缺损,以及糖尿病、静脉曲张等引起的皮肤溃疡是临床上常见的疾病,损害了病人的身体健康和生活质量。传统的皮肤缺损治疗方法主要是自体移植,即从人体的非重要部位切取部分皮肤移植到缺损部位进行修复。自体皮肤移植一方面皮肤来源有限,无法治疗大面积皮肤缺损,另一方面开辟第二术区会给患者造成了新的痛苦,并会导致皮肤供区的继发性畸形。 随着科学和技术手段的发展,已有越来越多的新方法用于皮肤缺损的治疗,组织工程皮肤(Tissue-engineered skin, TES)就是其中一种最有效的治疗手段。TES是通过将种子细胞接种到一定的基质材料中形成具有类似皮肤结构的复合物,植入体内以发挥其皮肤缺损的修复作用。目前,经过FDA批准的TES,如1997年批准的Transcyte(?),1998年批准的Apligraf(?)以及2001年批准的Dermagraft(?)都已经上市销售。目前使用的TES种子细胞通常来自于儿童的包皮,来源有限、体外扩增需要的时间较长,难以满足大量生产的需要。同时由于种子细胞来源有限而造成相关产品的价格较高,会给患者带来沉重的经济负担。 胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)是一种有前景的TES种子细胞的来源,相比于包皮来源的成纤维细胞,ESCs具有来源不受限、体外扩增速度快的优点,但应用时可能受到伦理学的限制。孤雌胚胎干细胞(Parthenogenetic embryonic stem cells, pESCs)来源于人工激活的孤雌囊胚,相对于正常的ESCs,不破坏活的胚胎,由于只具有母系的遗传物质,能大大减弱免疫排斥反应,因此是一种理想的种子细胞来源。 人和高等动物的皮肤主要由表皮层、真皮层和皮下组织组成,还含有皮肤附属器官。真皮层中主要细胞类型是成纤维细胞。我们的研究思路是先将pESCs扩增培养,然后悬浮培养形成拟胚体(Embryoid bodies, EBs),随后让EBs贴壁,经过连续培养和筛选获得间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSCs),在此基础上,用诱导因子诱导MSCs向成纤维细胞分化,将获得的具有成纤维细胞表型特征的细胞作为种子细胞,接种于胶原蛋白水凝胶构建出TES,并进行动物模型皮肤缺损修复实验。这种方法既可以获得来源充足的TES种子细胞,又可以避免ESCs应用相关的伦理学限制,而且pESCs的低免疫原性还可以减轻免疫排斥反应的程度,因此是一种最理想的构建TES的方法,文献中未见相关报道。 在本研究中,我们首先比较了pESCs和ESCs两种胚胎干细胞的全能性和EBs中细胞的分化能力,对EBs的进行贴壁培养期望获得MSCs。进一步通过分子生物学的方法检测了所获得的MSCs的性质,结果显示pESCs具有和ESCs相同的特征和三胚层形成能力,所获得的MSCs具有多系分化的能力。然后用所获得的MSCs进行诱导培养,获得了具有成纤维细胞表型特征的细胞。最后将获得的具有成纤维细胞表型特征的细胞接种于胶原水凝胶中构建出具有一定形态和机械强度的TES,并在小鼠背部进行缺损修复实验,通过大体标本观察和组织学观察评价修复的效果,结果表明诱导获得的成纤维细胞构建的TES具有和小鼠成纤维细胞构建的TES相似的皮肤缺损修复能力,并且pESCs来源的成纤维细胞构建的TES的修复效果和小鼠成纤维细胞构建的TES的修复效果没有显著差异(P0.05)。 (1) pESCs和ESCs两种胚胎干细胞全能性基因Nanog、Oct3/4和未分化状态标志基因SSEA-1均在胞浆中高表达,说明pESCs和ESCs保持了很好的未分化状态。畸胎瘤形成的结果显示pESCs和ESCs都具有向三胚层分化的全能性。外胚层、中胚层和内胚层的基因在EBs中依次表达,随后扩增EBs贴壁培养25天后迁移出的细胞获得MSCs。 (2)用分子生物学的方法检测获得的MSCs,流式细胞仪的结果显示,所获得的细胞表达MSCs的表面抗原；用MSCs分别向骨、软骨和脂肪方向诱导,组织化学结果显示,诱导得到的细胞胞浆中分别具有典型的钙结节,软骨基质和大量脂滴,说明所获得的MSCs具有向骨、软骨和脂肪方向分化的能力。在接下来的实验中,我们在MSCs培养液中加入了诱导因子培养获得了具有成纤维细胞典型特征的细胞,波形蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性。 (3)我们将所获得的具有成纤维细胞特征的细胞接种于胶原基质中,成功构建了TES,并与小鼠成纤维细胞所构建的TES进行修复效果的对比,大体形态观察和组织学HE结果显示具有基本相同的修复效果,比对照组修复愈合要提前约1-2天,并且比对照组修复效果要好。这说明pESCs能够被定向诱导成为具有成纤维细胞典型特征的细胞,是一种理想的TES的种子细胞。
【关键词】：pESCs ESCs 成纤维细胞 种子细胞 TES
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.0
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 文献综述11-18
• 1.1 ESCs的研究进展11-13
• 1.1.1 ESCs和pESCs的研究发展11-12
• 1.1.2 目前存在的问题12-13
• 1.2 TES的研究和进展13-15
• 1.2.1 TES的发展和分类13-14
• 1.2.2 种子细胞的来源14-15
• 1.2.3 目前存在的问题15
• 1.3 本实验研究的目的、意义及实验内容15-18
• 1.3.1 实验的目的和意义15-16
• 1.3.2 实验内容16-18
• 第二章 pESCs和ESCs的扩增培养和特征检测18-24
• 2.1 实验试剂18
• 2.2 实验动物18
• 2.3 实验仪器18
• 2.4 实验器材18-19
• 2.5 主要试剂配制19
• 2.5.1 PBS的配制19
• 2.5.2 4%多聚甲醛的配制19
• 2.5.3 0.1%Triton X-100的配制19
• 2.5.4 1%明胶的配制19
• 2.6 实验方法19-20
• 2.6.1 pESCs和ESCs的扩增培养19
• 2.6.2 标志基因的检测19-20
• 2.6.3 畸胎瘤的HE染色20
• 2.7 实验结果20-22
• 2.7.1 pESCs和ESCs的形态学观察21
• 2.7.2 标志基因的检测21
• 2.7.3 畸胎瘤的HE染色21-22
• 2.8 实验小结与讨论22-24
• 第三章 pESCs和ESCs形成EBs及获得MSCs24-32
• 3.1 实验试剂24
• 3.2 实验仪器24
• 3.3 实验器材24-25
• 3.4 主要试剂配制25
• 3.4.1 细胞扩增培养液25
• 3.4.2 PBS的配制25
• 3.5 实验方法25-27
• 3.5.1 EBs的形成和检测25
• 3.5.2 EBs的贴壁培养和MSCs的获得25-27
• 3.5.3 结果统计分析27
• 3.6 实验结果27-30
• 3.6.1 EBs的免疫荧光染色结果27-28
• 3.6.2 EBs的贴壁培养和检测28-30
• 3.7 实验小结与讨论30-32
• 第四章 MSCs多系分化能力的检测32-38
• 4.1 实验试剂32
• 4.2 实验仪器32
• 4.3 实验器材32
• 4.4 主要试剂配制32-33
• 4.4.1 细胞扩增培养液32-33
• 4.4.2 PBS的配制33
• 4.5 实验方法33-34
• 4.5.1 MSCs向成骨、软骨和脂肪方向的诱导33
• 4.5.2 MSCs多系分化能力的检测33-34
• 4.5.3 流式细胞仪检测细胞表面抗原34
• 4.6 实验结果34-36
• 4.6.1 MSCs的观察35
• 4.6.2 MSCs多系分化能力的检测35
• 4.6.3 MSCs表面抗原的检测35-36
• 4.7 实验小结与讨论36-38
• 第五章 MSCs向成纤维细胞的诱导38-48
• 5.1 实验试剂38
• 5.2 实验仪器38
• 5.3 实验器材38
• 5.4 主要试剂配制38-39
• 5.4.1 细胞扩增培养液38-39
• 5.4.2 诱导培养液的配制39
• 5.4.3 PBS的配制39
• 5.5 实验方法39-41
• 5.5.1 MSCs向成纤维细胞的诱导39
• 5.5.2 生长因子的实时定量PCR检测39-40
• 5.5.3 生长因子的ELISA检测40
• 5.5.4 波形蛋白和角蛋白的表达检测40
• 5.5.5 细胞表面抗原的检测40
• 5.5.6 结果统计分析40-41
• 5.6 实验结果41-46
• 5.6.1 诱导所获得细胞的形态学观察41
• 5.6.2 生长因子的实时定量PCR检测41-43
• 5.6.3 生长因子的ELISA检测43-45
• 5.6.4 免疫荧光检测45-46
• 5.7 实验小结和讨论46-48
• 第六章 TES的制备和移植实验48-57
• 6.1 实验试剂48
• 6.2 实验动物48
• 6.3 实验仪器48
• 6.4 实验器材48-49
• 6.5 主要试剂准备和配制49
• 6.5.1 10×DMEM培养液的配制49
• 6.5.2 DMEM培养液的配制49
• 6.5.3 PBS的配制49
• 6.5.4 脱毛剂的配制49
• 6.5.5 麻醉剂的配制49
• 6.5.6 其他试剂的配制49
• 6.6 实验方法49-52
• 6.6.1 胶原蛋白的提取49-50
• 6.6.2 不含细胞TES的制备50
• 6.6.3 含细胞TES的制备50
• 6.6.4 含细胞TES的培养和观察50-51
• 6.6.5 TES的移植51
• 6.6.6 取材及HE染色51
• 6.6.7 结果统计分析51-52
• 6.7 实验结果52-55
• 6.7.1 TES的观察52
• 6.7.2 移植实验52-55
• 6.8 实验小结和讨论55-57
• 结论57-59
• 参考文献59-66
• 附录66-68
• 致谢68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：331837