纳米羟基磷灰石—壳聚糖和壳聚糖支架材料异位成骨的对比研究

发布时间：2017-05-02 20:14

本文关键词：纳米羟基磷灰石—壳聚糖和壳聚糖支架材料异位成骨的对比研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：(DPercoll梯度离心法结合贴壁培养法分离、纯化、培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs),为组织工程骨的构建提供种子细胞。②对比评价纳米羟基磷灰石-壳聚糖(nano-hydroxyapatite-chitosan, nHA-CS)和壳聚糖(chitosan, CS)支架与大鼠BMSCs的生物相容性。③评价大鼠BMSCs成骨诱导后的成骨分化性能。④对比评价纳米羟基磷灰石-壳聚糖和壳聚糖支架材料的异位成骨能力。方法：①无菌分离8周龄健康SD大鼠股骨,冲洗骨髓腔获取骨髓,采用Percoll梯度离心法结合贴壁培养法获得形态较为单一的贴壁细胞。②将实验分为nHA-CS组、CS组以及对照组,采用计数法测定接种2h、4h、6h、8h、12h后的细胞粘附率,细胞粘附率=(接种细胞数-未粘附细胞数)/接种细胞数；采用CCK-8法测定细胞的生长曲线；倒置显微镜观察细胞在支架周围的生长情况；激光共聚焦显微镜扫描观察细胞在支架上的粘附生长状况。③在P3代BMSCs成骨诱导后3d,对其行钙-钴染色,检测细胞内碱性磷酸酶表达；成骨诱导后21天对其行Von Kossa染色和茜素红染色,检测细胞外钙盐沉积。④采用2月龄SPS级健康SD雄性大鼠65只,体重186.4g～217.5g,平均(202.9±7.2)g,将其随机分为五组：Ⅰ组为细胞复合nHA-CS支架组,Ⅱ组为细胞复合CS支架组,Ⅲ组为单纯nHA-CS支架组,Ⅳ组为单纯CS支架组,V组为空白对照组。将内植物植入大鼠肌袋内,分别于术后2、4、6、8、12周对大鼠股骨行CT扫描,组织标本切片HE染色和Masson染色以评估支架异位成骨情况。结果：①采用Percoll梯度离心法结合贴壁培养法获得大量形态较为均一,呈梭形和成纤维形,方向性排列的贴壁细胞。②nHA-CS组、CS组以及无支架对照组,接种2h、4h、6h、8h、2h后的细胞平均粘附率分别为：(80.23±4.73)%、(84.48±5.17)%、(86.77±3.10)%、(86.77±3.10)%、(88.02±2.07)%；(78.49±5.25)%、(83.12±5.45)%、(83.12±5.45)%、(87.04±3.95)%、(87.04±3.95)%：(84.42±4.27)%、(87.04±3.20)%、(89.38±3.02)%、(90.69±2.48)%、(90.69±2.48)%。统计分析显示在各个时间点细胞粘附率无明显统计学差异。细胞接种后1-4天nHA-CS组、CS组以及对照组细胞按照正常速度增殖,第5天细胞增殖速度有所下降,至6-9天三组细胞增殖速度均明显减缓,出现细胞增殖平台。三组曲线整体趋势相同,呈现“S”形。细胞支架复合培养24h后,nHA-CS支架和CS支架周围均可见细胞围绕支架边缘贴壁生长,细胞呈梭形,镜下透亮度高,细胞状态良好。激光共聚焦显微镜扫描见细胞接种48h后大量细胞粘附于nHA-CS支架和CS支架孔壁之上。③成骨诱导3d后,钙-钴法染色见细胞胞质内大量黑色颗粒状沉积,显示细胞内ALP表达；诱导21d后,Von Kossa法染色和茜素红染色,分别见细胞外基质内褐色和红色钙结节。④术后CT示各组植入物均位于大腿肌肉组织内靠近股骨。在术后第2周nHA-CS复合细胞组、单纯nHA-CS组和CS复合细胞组即可见新生骨组织形成,而单纯CS组则在6周以后才见新生骨形成。各组植入部位新骨形成随时间的延长而逐渐增加,并且在同一时间点nHA-CS复合细胞组的新骨形成要明显多于单纯nHA-CS组,CS复合细胞组明显多于单纯CS组。HE染色示2周时各组支架孔隙内骨样组织沉积,随时间延长,骨样组织逐渐增多,软骨样组织形成,骨化逐渐发生。对各组不同时间点的骨面积分数和支架剩余面积分数进行统计分析后发现：各组的骨面积分数随着时间的延长分别逐渐增加(P0.05),在相同时间点,各组的骨面积分数均有差异,nHA-CS复合细胞组最高,其次分别为CS复合细胞组、单纯nHA-CS组、单纯CS组(P0.05)；而随时间延长各组的支架剩余分数分别逐渐降低(P0.05),在相同时间点,单纯CS组的支架剩余面积分数最高,其次分别为单纯nHA-CS组、CS复合细胞组、nHA-CS复合细胞组(P0.05)。Masson染色显示胶原蛋白首先在骨样沉积组织之间产生,后逐渐增多交织呈网状、板层状,构成成骨细胞的细胞外基质。统计分析胶原面积分数发现：随时间增加,各组胶原面积分数逐渐增加(P0.05)；在相同时间点,不同组之间的胶原面积分数以nHA-CS复合细胞组最高,其次分别为CS复合细胞组、单纯nHA-CS组、单纯CS组(P0.05)。结论：①Percoll密度梯度离心法结合贴壁培养法是一种理想的分离BMSCs的方法。②nHA-CS支架和CS支架与BMSCs之间均均有良好的体外生物相容性,二者在对细胞生长的影响、细胞粘附效率等方面均无明显差异。③采用含有10-8mol/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸钠和50mg/L维生素C的完全培养基作为成骨诱导体系,能够成功诱导BMSCs向成骨细胞分化,诱导后细胞具有良好的成骨性能。④nHA-CS支架和CS支架复合成骨诱导后的BMSCs均具有优良的异位成骨能力,但nHA-CS支架的成骨性能明显优于CS支架,可作为优秀的骨组织工程修复材料
【关键词】：异位成骨 骨髓间充质干细胞 纳米羟基磷灰石-壳聚糖 壳聚糖
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08;R687
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