Lysine-cyclic RGD肽的设计及其运用于选择性细胞滞留技术的应用基础研究
本文关键词：Lysine-cyclic RGD肽的设计及其运用于选择性细胞滞留技术的应用基础研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：研究背景及目的:理想的骨修复材料一直是骨外科的亟需品,然而目前的研究遭遇重重障碍,最具希望的骨组织工程也由于其种子细胞、支架材料和构建策略三大要素分别面临诸多难题而致使其发展应用遭遇瓶颈。选择性细胞滞留技术是传统骨组织工程在构建策略上的一种改良手段,这种改良不仅可以突破传统骨组织工程在构建策略上的关键性难题,并且由于采用自体骨髓的细胞成分作为即用型种子细胞,若策略得当,可同时解决传统骨组织工程种子细胞在扩增周期、潜在致瘤性、免疫原性以及伦理学等方面诸多棘手的难题,这样一来,支架材料的性能便成为了选择性细胞滞留技术最为关键的决定因素。由于选择性细胞滞留技术旨在尽量缩短构建时间以满足临床上对骨修复材料随取随用的要求,如此其要求的支架材料需要在性能上兼顾生物相容性、骨诱导性和快速的细胞粘附能力。基于以上背景,我们设想将成熟的促粘修饰物赖氨酸序列与具备特异性粘附能力和成骨诱导能力的RGD序列相结合,设计制备出Lysine-cyclic RGD(Lc RGD)肽,以物理电荷和生物配基相结合的方式协调非特异性粘附与特异性粘附,并在提高选择性细胞滞留技术中支架材料对骨髓中细胞快速粘附能力的同时兼顾成骨诱导能力。方法:(1)查阅文献,根据对合成物目标性能的实际要求,选用了具备较长半衰期、较好细胞粘附性并兼顾对MSCs成骨诱导性能的c(RGDf K)环五肽作为主体结构,再加上20K的赖氨酸序列以增强其非特异性粘附能力,最终课题组设计了LcRGD肽的结构,并以固态合成法和HPLC法等进行了制备、纯化和验证,以LcRGD肽对DBM进行了修饰并以激光共聚焦显微镜、环境扫描电镜、能谱分析等方法验证了修饰的有效性和稳定性。(2)以离心细胞粘附实验、CCK-8法、Western Blot、qPCR、碱性磷酸酶活性检测等方法在体外检测了LcRGD肽对间充质干细胞的粘附性能和成骨诱导能力。(3)以流式细胞仪、裸鼠股骨旁成骨实验、影像学方法和病理学方法检测了DBM/LcRGD支架材料对骨髓中有核细胞的粘附能力和体内成骨能力。结果:(1)课题组成功设计和获取了高纯度的Lc RGD肽,环境扫描电镜观察到经LcRGD肽修饰的DBM表面粗糙度有所提高,能谱分析亦显示Lc RGD肽被成功地修饰于DBM表面。以带FITC荧光的LcRGD肽修饰DBM后以激光共聚焦显微镜进行三维重建,证实了修饰的有效性,随后将DBM/LcRGD-FITC支架材料以PBS缓冲液进行高载荷的模拟富集后再次以激光共聚焦显微镜进行三维重建,结果显示LcRGD-FITC肽经过较高强度的冲刷后仍然较为稳定地修饰于DBM表面。(2)离心细胞粘附实验结果显示,相对于普通cRGD肽修饰的盖玻片和未经修饰的盖玻片,Lc RGD肽修饰的盖玻片对体外培养的间充质干细胞在早期便具有更强的粘附能力。CCK-8实验证实了以MSCs细胞悬液模拟选择性细胞滞留技术后,相对于DBM/cRGD和DBM支架材料,DBM/LcRGD支架材料滞留了更多MSCs,并且MSCs在DBM/LcRGD支架材料上的增殖最先到达峰顶密度。将以MSCs细胞悬液模拟选择性细胞滞留技术后DBM/LcRGD、DBM/c RGD和DBM支架材料以成骨诱导培养基进行诱导后以q PCR、WesternBlot和碱性磷酸酶活性检测试剂盒进行检测,结果发现DBM/LcRGD组具有更高的Runx2、ALP、OPN和OCN的基因表达水平和蛋白表达水平,以上结果表明LcRGD肽具有更好的诱导MSCs成骨分化的能力。(3)以选择性细胞滞留技术采用健康成人骨髓对DBM/LcRGD、DBM/c RGD和DBM支架材料进行富集,流式细胞仪结果显示DBM/LcRGD组对骨髓中有核细胞、单核细胞、CD90+/CD105+双阳性细胞以及CD34+细胞的富集效率显著高于对照组并展现出了一定的靶向粘附能力。以裸鼠股骨旁成骨实验对DBM/Lc RGD和DBM支架材料进行体内实验观察,影像学和病理学方法均显示DBM/LcRGD组具有更好的体内成骨能力。结论:以设计制备的Lc RGD肽修饰DBM所得的DBM/LcRGD支架材料具有良好的生物相容性、细胞粘附能力和成骨诱导性能,在运用于选择性细胞滞留技术时其对骨髓中细胞的粘附滞留能力较好并展现出一定的靶向粘附能力,最终亦展现了较好的体内成骨能力。作为运用于骨组织工程的支架材料修饰物,LcRGD肽尤其适用于选择性细胞滞留技术并具有良好的实际应用前景。
【关键词】：组织工程 选择性细胞滞留技术 生物材料 合成肽 RGD肽
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08;R687
【目录】：
- 缩略语表4-6
- 英文摘要6-8
- 中文摘要8-10
- 第一章 前言10-13
- 第二章 Lysine-cyclic RGD肽的设计及DBM/Lysine-cyclic RGD支架材料的制备13-22
- 2.1 材料与方法13-16
- 2.2 结果16-21
- 2.3 讨论21-22
- 第三章 Lysine-cyclic RGD肽对间充质干细胞粘附、增殖及成骨分化的影响22-39
- 3.1 材料与方法22-33
- 3.2 结果33-37
- 3.3 讨论37-39
- 第四章 DBM/Lysine-cyclic RGD在选择性细胞滞留技术中的应用39-49
- 4.1 材料与方法39-43
- 4.2 结果43-47
- 4.3 讨论47-49
- 全文总结49-50
- 参考文献50-54
- 文献综述 RGD序列肽的生物学效应及其应用54-60
- 参考文献57-60
- 攻读硕士学位期间发表论文情况60-61
- 致谢61
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 孙红;真皮支架材料的研究进展[J];中国美容医学;2004年01期
2 崔福斋,孟波,张金山;介入治疗中支架材料的研究进展[J];中国介入影像与治疗学;2004年01期
3 吴燕,成国祥;可注射可吸收凝胶支架材料的研究进展[J];生物医学工程学杂志;2005年01期
4 丁敏;;厦大研制出可将组织器官“种”在体外的医用支架材料[J];功能材料信息;2006年04期
5 陈思;董念国;史嘉玮;;组织工程心脏瓣膜支架材料进展[J];心血管病学进展;2008年06期
6 王雪力;侯理;谭竞;汤克勤;夏和生;刘霆;;生物相容性聚氨酯支架材料的研究[J];高分子材料科学与工程;2008年02期
7 邹明晖;董念国;;组织工程心脏瓣膜支架材料的研究与进展[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年29期
8 哈里木·克里木;王磊;齐海;;组织工程心脏瓣膜支架材料的选择与应用[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年34期
9 郭各朴;马青玉;王f ;赵波;章东;;聚乳酸微孔支架材料热分解动力学特性[J];科学通报;2011年34期
10 张东宪;孙鹏霄;黄兆松;卢旭;韩一生;;用于人工韧带的聚对苯二甲酸乙二醇酯支架材料的编织和力学性能分析[J];现代生物医学进展;2012年12期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张亚;王晓东;;细胞复合型丝素支架材料修复兔桡骨骨缺损[A];苏州市自然科学优秀学术论文汇编(2008-2009)[C];2010年
2 杨光辉;王英杰;张世昌;刘涛;;聚氨酯支架材料内肝细胞培养的初步研究[A];第一届全国疑难重型肝病大会、第四届全国人工肝及血液净化学术年会论文集[C];2008年
3 赵斌;马信龙;孙晓雷;李秀兰;马剑雄;徐康;张杨;郭跃;;低渗联合冻干改良制备脱细胞神经支架材料的研究[A];第十九届全国中西医结合骨伤科学术研讨会论文汇编[C];2012年
4 儕y，
本文编号：356126
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/swyx/356126.html
