体外构建血管化组织工程心肌的研究

发布时间：2017-05-21 18:24

  本文关键词：体外构建血管化组织工程心肌的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的本研究用5-氮胞苷对获取的大鼠骨髓间充质干细胞进行诱导，内皮生长培养基MV2（EGM-2MV）对获取的骨髓源性内皮祖细胞进行诱导，将诱导获取的心肌细胞、内皮细胞以2:1比例混合种植于Matrigel基质胶上，进行组织工程心肌的血管化，以探索在体外进行血管化组织工程心肌构建的可能性。 方法1骨髓间充质干细胞的分离、培养及诱导：利用全骨髓贴壁培养的方法分离获取骨髓间充质干细胞；5-氮胞苷作为诱导剂，对其向心肌细胞进行定向诱导。诱导前后，免疫细胞化学法行细胞鉴定：骨髓间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD34；心肌细胞表面标志物cTnT。2骨髓源性内皮祖细胞的分离、培养及向内皮细胞的诱导：取3周龄SD大鼠，分离出股骨、胫骨，等量淋巴细胞分层液分离，收集单个核细胞，通过EGM-2MV条件培养基对骨髓源性内皮祖细胞进行培养。通过CD31、CD34和CD133等表面标志物的表达情况对细胞进行鉴定。3体外构建组织工程化心肌：将骨髓源性心肌细胞用DAPI标记、骨髓源性内皮细胞用CM-dil标记，实验组以2:1比例种植于Matrigel基质胶并进行共同培养；对照组以1:0的比例进行种植培养。不同时间点观察细胞复合体的形态，免疫荧光显微镜下和苏木精-伊红染色方法观察两种细胞的分布情况并进行心肌细胞凋亡检测。采用SPSS19.0统计软件进行数据分析。计量资料选用均数±标准差（x±s）表示，组间对比采用t检验，P值0.05为差异有统计学意义。 结果1骨髓间充质干细胞原代细胞接种后少数细胞贴壁，形状不规则，可呈多种形态，如：纺锤形、不规则形；之后细胞形态不断变化，最终呈集落样增殖，，细胞呈梭形并以放射状或者漩涡状形态向四周扩增。细胞传代后，混合杂细胞被清除，骨髓间充质干细胞分布均匀，形态单一，呈长梭形，且增殖明显高于原代细胞。骨髓间充质干细胞表面标记物CD29、CD44阳性表达，CD34阴性表达。即胞浆中有棕黄色颗粒为阳性表达，反之为阴性。2P3代骨髓间充质干细胞生长状况：接种第2天因胰酶消化作用及适应新的生长环境细胞数稍有减少；第3天开始细胞数有所增长；到了第6天，细胞数明显开始升高，说明此时细胞处于分裂增殖期；第9天时，细胞数达到最多。3获取的骨髓间充质干细胞在心肌细胞的定向诱导过程的初期（24h后）部分细胞因5-氮胞苷的毒性作用而死亡，经过1周的药物诱导后可出现临近细胞彼此融合；2周后，细胞呈圆柱形或多角形，细胞接触紧密；4周后，细胞呈梭形，漩涡状生长。诱导后细胞免疫组织化学染色显示cTnT阳性表达。通过细胞计数，确定诱导后细胞的阳性率在90%以上。4分离培养的大鼠骨髓源性内皮祖细胞接种后细胞逐渐贴壁，呈小杆状或梭形等多种形态。5天时为集落样生长：中央细胞密集，周围单层细胞放射状罗列，2周时多数单层细胞为多角形，融合成片状，呈所谓“铺路石样”外观。细胞免疫组织化学染色显示CD31、CD34和CD133阳性表达。通过细胞计数，确定诱导后细胞的阳性率在90%以上。5第3代内皮细胞生长曲线：接种第2天因胰酶消化作用及适应新的生长环境细胞数未见增多，48小时后贴壁伸展，3天后开始大量增殖，5天后进入对数生长期，细胞数明显增多，8天以后增长趋势逐渐减缓，趋于平稳。6苏木精-伊红染色及荧光显微镜显示心肌内皮细胞/Matrigel基质胶复合体内细胞密度均匀，心肌细胞胞核呈蓝色圆形荧光，内皮细胞胞浆呈红色荧光。7心肌细胞与内皮细胞共培养24h后，2:1组复合体可出现内皮细胞典型的“成血管现象”；1:0组可见细胞均匀生长，却无“成血管现象”。8TUNEL细胞凋亡检测显示2:1组比1:0组的凋亡心肌细胞少。9通过血管计数结果显示，心肌内皮细胞/Matrigel基质胶组（12±2.69）形成的血管样结构明显多于心肌细胞/Matrigel基质胶组（1±0.79）。 结论1骨髓间充质干细胞经5-aza诱导可以获得阳性率较高的心肌细胞。2等量淋巴细胞分层液分离获取骨髓源性内皮祖细胞并用EGM-2MV条件培养基进行培养，可以获得活性好、阳性率高的骨髓源性内皮细胞。3骨髓源性心肌细胞与骨髓源性内皮细胞以2:1的比例联合种植于Matrigel基质胶共培养，可于体外成功构建血管化组织工程心肌。
【关键词】：血管化 心肌细胞 内皮细胞 组织工程
【学位授予单位】：河北联合大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-13
• 第1章 实验研究13-41
• 1.1 材料与方法13-20
• 1.1.1 实验材料13-16
• 1.1.2 实验方法16-20
• 1.1.3 统计学分析20
• 1.2 结果20-29
• 1.2.1 大鼠 BMSCs 细胞形态学及表面抗原检测20-23
• 1.2.2 BMSCs 向心肌细胞诱导23-24
• 1.2.3 骨髓源性内皮祖细胞形态学及相关抗原检测24-26
• 1.2.4 细胞/Matrigel 基质胶支架复合体26-27
• 1.2.5 细胞-支架材料复合体成血管能力的检测27-28
• 1.2.6 TUNEL 细胞凋亡检测28-29
• 1.3 讨论29-36
• 1.3.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养及向心肌细胞的诱导分化30-32
• 1.3.2 骨髓源性内皮祖细胞分离、培养及向内皮细胞的诱导分化32-33
• 1.3.3 支架材料33-34
• 1.3.4 组织工程心肌的血管化34-36
• 1.4 结论36
• 参考文献36-41
• 第2章 综述 心肌组织工程的研究进展41-52
• 2.1 心肌组织工程种子细胞来源41-43
• 2.2 心肌组织工程的支架材料43-45
• 2.3 工程化心肌组织的体外构建45-46
• 2.4 工程化心肌组织的再血管化46-47
• 2.5 问题与展望47
• 参考文献47-52
• 致谢52-53
• 导师简介53-54
• 作者简介54-55
• 学位论文数据集55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

1 武金霞;单彪;习洋;甄兴航;张贺迎;;蚯蚓冻干粉的抗氧化作用[J];河北大学学报(自然科学版);2010年01期

2 李舜尧;;胎鼠心肌与肝脏细胞的体外生长特性[J];内蒙古大学学报(自然科学版);2008年04期

3 皮淑芳;王怀祯;李彤;王禹;;干细胞移植与心脏疾病治疗[J];生物医学工程与临床;2010年02期

4 汪浩文;何志旭;王志华;刘俊峰;;大鼠骨髓间充质干细胞多向分化潜能的研究[J];复旦学报(医学版);2009年05期

5 邢玉洁;吕安林;赵晓梅;李飞;王利;杜娟娟;;心肌组织工程的研究现状[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年02期

6 伍长学;马建e

本文编号：384475