一种负载生长因子碳纳米管鱼皮胶原基复合支架材料的研究

发布时间：2017-05-23 14:09

  本文关键词：一种负载生长因子碳纳米管鱼皮胶原基复合支架材料的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：由创伤和疾病等多种因素导致的关节软骨损伤甚至缺损是骨科常见的问题,也是临床治疗的难点,组织工程学的发展为其提供了一种新的治疗方案。本研究针对损伤累及软骨下骨的骨软骨损伤适应症,参照天然软骨组织中胶原纤维的取向,以鱼皮胶原蛋白为基质材料,通过复合羧基化碳纳米管(SWNT-COOHs)和转化生长因子(TGF-β1),制备了一种负载生长因子碳纳米管鱼皮胶原基复合支架材料(Collagen/SWNT-COOHs scaffold with TGF-β1),并对其理化性能、生物相容性以及该材料对软骨组织工程种子细胞的作用进行了研究。研究内容及结果如下：1.采用酶解法提取鱼皮胶原,复合羧基化碳纳米管,经过交联、冷冻干燥、负载生长因子等过程,制备了负载生长因子碳纳米管鱼皮胶原基复合支架材料,并对材料进行了FTIR、SEM等理化表征。结果表明：(1)材料中鱼皮胶原蛋白保持了典型三螺旋结构,无变性和降解发生,并经D-核糖作用发生了有效交联；(2)负载生长因子碳纳米管鱼皮胶原基复合支架材料具有良好的孔隙结构,孔隙率达到了90%以上。2.体外培养SD大鼠软骨细胞,接种于未负载和负载TGF-β1的碳纳米管鱼皮胶原基复合支架材料和胶原基支架材料表面,考察了细胞在1、3、5、7 d的生长情况。结果表明：(1)软骨细胞在所有材料上都表现出粘附和增殖,其中2.0 wt%组粘附率在接种1h即达到90%以上,制备的支架材料具有良好的生物相容性；(2)与未负载TGF-β1复合支架材料组相比,负载TGF-β1的复合支架材料组软骨细胞增值率较高；(3)随培养时间的延长,各组复合支架材料上软骨细胞GAG含量增加,尤以0.5 wt%组和1.0 wt%组复合支架材料增长明显。3.应用MTT、荧光染色、细胞总蛋白含量和GAG表达量检测等方法,考察了制备的负载生长因子碳纳米管鱼皮胶原基复合支架材料对SD大鼠间充质干细胞(BMSCs)的增殖和诱导分化的作用。结果表明：BMSCs在负载TGF-β1复合支架上增殖和代谢能力旺盛,复合支架材料具有较好的促BMSCs诱导成软骨细胞的作用,不同复合支架材料对BMSCs诱导成软骨细胞增殖和分化效果依次为0.5 wt%组1.0 wt%组0 wt%组2.0 wt%组。总之,本研究构建的负载生长因子碳纳米管鱼皮胶原基复合支架材料生物相容性良好,能有效诱导BMSCs成软骨分化,如进一步的工艺优化和深入研究,有望成为一种良好的骨软骨损伤修复的组织工程支架材料。
【关键词】：碳纳米管 鱼皮胶原 骨髓间充质干细胞 生物相容性 骨软骨修复
【学位授予单位】：福州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 中文摘要3-4
• Abstract4-10
• 第一章 绪论10-22
• 1.1 关节软骨的损伤修复10-11
• 1.2 软骨组织工程支架材料11-16
• 1.2.1 胶原蛋白11-13
• 1.2.2 碳纳米管13-16
• 1.3 软骨组织工程中的种子细胞16-18
• 1.3.1 自体或异体软骨细胞16-17
• 1.3.2 成体干细胞17-18
• 1.3.3 胚胎干细胞18
• 1.4 软骨组织工程生长因子18-19
• 1.5 论文的研究内容以及目的和意义19-22
• 1.5.1 研究目的19
• 1.5.2 研究的意义19
• 1.5.3 研究的主要内容19-22
• 第二章 负载生长因子碳纳米管鱼皮胶原基复合支架材料的制备及性能表征22-33
• 2.1 实验材料与仪器22-23
• 2.1.1 实验材料22
• 2.1.2 实验试剂22-23
• 2.1.3 实验仪器23
• 2.2 实验方法23-26
• 2.2.1 鱼皮胶原蛋白的提取23-24
• 2.2.1.1 预处理23
• 2.2.1.2 酶解23-24
• 2.2.1.3 盐析与透析24
• 2.2.1.4 冷冻干燥24
• 2.2.2 负载生长因子碳纳米管鱼皮胶原基复合支架材料的制备24-25
• 2.2.2.1 SWNT-COOHs的纯化24
• 2.2.2.2 碳纳米管鱼皮胶原基复合支架材料的制备24
• 2.2.2.3 碳纳米管鱼皮胶原基复合材料的交联24-25
• 2.2.2.4 负载生长因子复合材料的制备25
• 2.2.3 鱼皮胶原及复合支架材料的表征25-26
• 2.2.3.1 鱼皮胶原的SDS-PAGE电泳25
• 2.2.3.2 鱼皮胶原蛋白的圆二色谱鉴定25
• 2.2.3.3 傅立叶变换红外光谱25
• 2.2.3.4 扫描电镜分析25-26
• 2.2.3.5 孔隙率的测定26
• 2.3 实验结果与讨论26-32
• 2.3.1 鱼皮胶原蛋白的SDS-PAGE电泳分析26-27
• 2.3.2 胶原蛋白的圆二色谱分析27
• 2.3.3 复合支架材料的红外光谱分析27-29
• 2.3.4 扫描电镜分析29-31
• 2.3.4.1 复合支架材料中碳纳米管和胶原纤维的相互作用30
• 2.3.4.2 交联前后复合支架结构变化30-31
• 2.3.5 复合支架孔隙率的测定分析31-32
• 2.4 小结32-33
• 第三章 种子细胞的分离、培养及鉴定33-45
• 3.1 实验材料与仪器33-34
• 3.1.1 实验材料33
• 3.1.2 实验试剂33-34
• 3.1.3 实验仪器34
• 3.2 实验方法34-38
• 3.2.1 溶液配制34-35
• 3.2.2 SD大鼠剑突软骨细胞和骨髓间充质干细胞原代培养35-36
• 3.2.2.1 分离软骨细胞35
• 3.2.2.2 分离骨髓间充质干细胞35-36
• 3.2.3 细胞的纯化和传代培养36
• 3.2.4 细胞的冻存和复苏36
• 3.2.5 软骨细胞的鉴定36-37
• 3.2.5.1 显微镜下细胞形态观察36-37
• 3.2.5.2 软骨细胞甲苯胺蓝染色37
• 3.2.5.3 软骨细胞免疫组化染色37
• 3.2.6 骨髓间充质干细胞的鉴定37-38
• 3.2.6.1 显微镜下BMSCs形态观察37
• 3.2.6.2 MTT法测定BMSCs生长曲线37-38
• 3.3 实验结果与讨论38-43
• 3.3.1 软骨细胞原代培养形态观察结果分析38
• 3.3.2 软骨细胞传代培养形态观察结果分析38-40
• 3.3.2.1 同代软骨细胞培养形态观察结果分析39
• 3.3.2.2 异代软骨细胞培养形态观察结果分析39-40
• 3.3.3 软骨细胞甲苯胺蓝染色结果分析40-41
• 3.3.4 软骨细胞免疫组化染色结果分析41
• 3.3.5 BMSCs培养形态观察结果分析41-43
• 3.3.6 生长曲线的绘制43
• 3.4 小结43-45
• 第四章 负载生长因子碳纳米管鱼皮胶原基复合支架材料对软骨细胞的影响45-55
• 4.1 实验材料与仪器45-46
• 4.1.1 实验材料45
• 4.1.2 实验试剂45-46
• 4.1.3 实验仪器46
• 4.2 实验方法46-48
• 4.2.1 软骨细胞增殖测定46-47
• 4.2.2 软骨细胞粘附率的测定47
• 4.2.3 软骨细胞糖胺聚糖(GAG)的测定47-48
• 4.3 结果与讨论48-54
• 4.3.1 软骨细胞增殖测定结果分析48-51
• 4.3.2 软骨细胞粘附率的测定结果分析51-52
• 4.3.3 软骨细胞GAG含量的测定结果分析52-54
• 4.4 小结54-55
• 第五章 负载生长因子碳纳米管/胶原基复合材料对BMSCs诱导分化的影响55-68
• 5.1 实验材料与仪器55-57
• 5.1.1 实验材料55
• 5.1.2 实验试剂55-56
• 5.1.3 实验仪器56-57
• 5.2 实验方法57-60
• 5.2.1 溶液的配制57-58
• 5.2.2 BMSCs诱导成软骨细胞的增殖测定58
• 5.2.3 BMSCs诱导成软骨细胞的蛋白含量测定58-59
• 5.2.4 BMSCs诱导成软骨细胞糖胺聚糖(GAG)的测定59
• 5.2.5 BMSCs诱导成软骨细胞组化染色59
• 5.2.6 Hoechst33258-PI荧光双染色59-60
• 5.2.7 SEM电镜扫描60
• 5.3 实验结果与讨论60-67
• 5.3.1 BMSCs诱导成软骨细胞增殖测定结果分析60-61
• 5.3.2 BMSCs诱导成软骨细胞蛋白含量测定结果分析61-63
• 5.3.3 BMSCs诱导成软骨细胞糖胺聚糖(GAG)的测定结果分析63
• 5.3.4 BMSCs诱导成软骨细胞组织化学染色分析63-65
• 5.3.5 Hoechst33258-PI荧光双染色分析65-66
• 5.3.6 复合支架材料上培养BMSCs电镜扫描分析66-67
• 5.4 小结67-68
• 第六章 结论与展望68-70
• 6.1 结论68-69
• 6.2 创新69
• 6.3 展望69-70
• 参考文献70-77
• 致谢77-78
• 个人简历78-79
• 在校期间的研究成果及发表的论文79

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本文编号：388159