TGF-β1基因转染BMSCs复合蚕丝蛋白-壳聚糖支架构建功能软骨的研究

发布时间：2017-05-25 18:16

  本文关键词：TGF-β1基因转染BMSCs复合蚕丝蛋白-壳聚糖支架构建功能软骨的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：骨关节炎（Osteoarthritis）是严重影响人类生活的疾病之一，由于关节软骨内缺乏血液供应，一旦损伤，自我修复能力极差，而且病情会随着时间逐步进展。随着我国乃至全球老年人口的增加，骨关节炎发病率处于上升趋势，同时骨关节疾病开始趋于年轻化，而且人数还在不断增加。目前关节软骨缺损的治疗方法虽然给软骨缺损修复带来了新希望，但是仍存在不足之处，主要包括需要从供区取出骨、软骨组织或在正常组织上钻孔，给供区造成新的损伤，而且需要至少2次以上的手术，同时由于供体来源有限，不能完全满足临床需求，因此，寻求一种替代骨软骨移植物是急需解决的问题。本工作在文献报道和前期研究的基础上，以壳聚糖和蚕丝蛋白为原材料通过冷冻干燥法来制作支架，然后将TGF-β1质粒DNA转染的BMSCs作为种子细胞种植在支架上构建组织工程化培养模型，并自行分泌生长因子，通过自分泌和旁分泌作用，在微环境下诱导BMSCs向软骨细胞分化。研究结果对修复骨软骨缺损有重大的意义，也为治疗骨关节炎提供一定的临床参考。因此，研究工作对于相关骨软骨疾病的治疗与康复进行了有意义的探索。 方法： 1采用密度梯度离心法分离大鼠BMSCs,并对所获得的细胞进行体外培养及鉴定。研究骨髓间充质干细胞的分离培养方法，了解其一般生物学特性，为进一步研究打下基础。 2蚕丝蛋白-壳聚糖组织工程支架的制备：蚕丝蛋白与壳聚糖按不同比例制备三种蚕丝蛋白-壳聚糖支架，对制备的支架进行傅里叶红外光谱结构分析；考察复合支架的密度、孔隙率、热水溶失率、力学性能、吸水膨胀率、抑菌能力等理化性质；支架接种细胞后用MTS法考察细胞在支架上培养1、3、5、7d的增殖情况；SEM扫描电镜观察各组支架的孔径大小、形态及细胞在最优支架上培养2、5d的黏附情况；HE染色观察细胞在最优支架上培养5、10d的形态及渗透生长情况。 3基因转染及鉴定：取TGF-β1质粒及其空载体质粒转化感受态细胞涂板，并挑单克隆，用LB培养基扩增，小量提取质粒、测序。通过脂质体法将获得的TGF-β1质粒及其空载体质粒转染第三代BMSCs：具体操作步骤按照脂质体lipofection2000说明书进行。转染48h后行逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）检测TGF-β1mRNA表达水平。 4组织工程化培养模型的建立：用0.25%胰酶消化转染TGF-β1质粒、转染空载体质粒48h后的第三代BMSCs及空白对照组的第三代BMSCs，含10%胎牛血清的LG-DMEM培养基终止消化，重悬细胞，计数，以2×106/mL接种到支架上，每块支架接种约20μL细胞悬液，构建组织工程化培养模型。实验共分三组：A组（TGF-β1质粒转染组）、B组（空载体质粒转染组）和C组（空白对照组）。 5组织工程化培养模型体外培养3、6、9、12d后分别行酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immnosorbent assay，ELISA）法检测培养液上清中TGF-β1蛋白的含量。 6组织工程化培养模型体外培养3、6、9、12d后分别利用阿利新蓝法测定培养液上清中酸性糖胺多糖的含量。 7组织工程化培养模型体外培养2周后行逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）检测支架细胞复合体中Ⅱ型胶原、Sox9mRNA的表达水平。 结果： 1采用密度梯度离心法可以成功分离大鼠BMSCs,可见原代细胞刚接种时散在分布，呈圆形，24h后有部分细胞贴壁。贴壁细胞呈长梭形或多角形，第3-7d，细胞融合生长，呈梭形且呈集落样增殖，7-10d可以达到80-90%融合，传代后细胞生长明显加速，生长活跃，并呈典型的漩涡样生长。随着传代次数的增加，可得到高纯度的BMSCs。经3次传代后，细胞形态较为一致。 2取生长状态良好的第三代BMSCs，经过成软骨、成骨诱导液诱导后,分别采用天狼猩红染色、甲苯胺蓝染色、ALP染色及茜素红染色来鉴定诱导后软骨细胞、成骨细胞表型。结果证实本实验采用密度梯度离心法提取的BMSCs具有多向分化潜能。 3傅里叶红外光谱证明：壳聚糖由糖特征结构β-1，4糖苷键相互连接而成，故各组在1154cm-1及897cm-1处出现了特征性吸收峰，对于CS-SF支架材料来说，随着CS含量的增高，代表无规卷曲/α螺旋结构的吸收峰1654cm-1和1540cm-1不断减小，而对应于1628cm-1和1516cm-1处相当于β-折叠结构的吸收峰不断增大，表明CS的加入改性了SF的结构，使α螺旋结构/无规卷曲向β-折叠结构转变；各组密度分别为0.18±0.03，0.20±0.01，0.18±0.04（g/ml）；孔隙率分别为87.36±2.15，77.82±1.37，72.22±1.37（%）；热水溶失率分别为：0，0，3.12±1.26（%）；弹性模量分别为：8.35±2.64，15.50±1.64，12.55±3.37(KPa)；吸水膨胀率分别为：1528.52±194.63，1078.22±100.52，1320.05±179.97（%）；抑菌圈直径分别为：18±1，22±2，20.33±1.53(mm)；SEM下观察1组支架孔径在50-250μm之间，孔径大小较为一致，孔相通性好，其它两组结构紊乱，孔径大小不一，孔相通性差；生长曲线结果示：1d时1组中活细胞数明显高于2组(P0.01)，3d、5d和7d时，1组中活细胞数量明显高于2组和3组(P0.01)；SEM可见细胞呈梭形黏附于支架上，随着培养天数的增加周围出现较多量细胞外基质；HE染色发现BMSCs在培养初期沿着支架材料内部空隙贴壁生长，随着培养天数的增加，贴壁细胞呈集落样生长，可明显看到细胞间连接；结果证实：CS-SF支架的细胞相容性良好，能促进BMSCs的存活和黏附，可以为细胞提供一个开放的生长环境，促进细胞向支架内部生长，并保证足够的营养和气体交换。 4脂质体介导的TGF-β1质粒及其空载体质粒瞬时转染大鼠第三代BMSCs,转染48h后行逆转录聚合酶链式反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）检测TGF-β1mRNA的表达水平。RT-PCR结果表明A组TGF-β1mRNA的表达水平高于B组和C组（P0.01）。 5组织工程化培养模型体外培养3、6、9、12d后分别行酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immnosorbent assay，ELISA）法检测培养液上清中TGF-β1蛋白的含量，结果显示：四个时点，A组的TGF-β1分泌量都高于B组和C组（P0.05），同时A组TGF-β1单日分泌量呈逐渐下降趋势，B组和C组TGF-β1单日分泌量则始终呈低表达趋势。 6组织工程化培养模型体外培养3、6、9、12d后分别利用阿利新蓝法测定培养液上清中酸性糖胺多糖的含量。结果显示：3、6、12d三个时点，A组培养液上清中GAG含量明显高于B组和C组（P0.01）。同时A组GAG单日分泌量呈逐渐上升趋势，B组和C组GAG单日分泌量则始终呈低表达趋势。证实A组细胞出现成软骨分化趋势。 7组织工程化培养模型体外培养2周后提取总RNA，行逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）检测支架细胞复合体中Ⅱ型胶原、Sox9mRNA的表达水平。结果显示：A组表达Ⅱ型胶原、Sox9mRNA，B组和C组则无Ⅱ型胶原和Sox9两种软骨细胞特异性标志基因的表达。 结论： 1密度梯度离心法可以成功分离大鼠BMSCs，所分离的BMSCs具有多向分化潜能。 2蚕丝蛋白和壳聚糖均为天然生物材料，原料易得，生物相容性好，，本研究将蚕丝蛋白与壳聚糖复合，通过强烈的氢键和离子键作用，改善其理化性能，并开发出适合于软骨组织工程领域的蚕丝蛋白-壳聚糖复合支架材料。 3脂质体法成功将TGF-β1基因真核表达型质粒及其空载体质粒转染到生长状态良好的第三代BMSCs，然后将转染48h后的第三代BMSCs接种到支架上，构建组织工程化培养模型。A组组织工程化培养模型培养两周后，分别从多个方面证实了组织工程化培养模型的成软骨能力。
【关键词】：蚕丝蛋白 壳聚糖 软骨组织工程 骨髓间充质干细胞 基因转染 诱导分化
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R684.3;R318.08
【目录】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 英文缩写13-15
• 前言15-16
• 材料与方法16-35
• 结果35-40
• 附图40-54
• 附表54-56
• 讨论56-62
• 结论62-63
• 参考文献63-66
• 综述 细胞共培养技术及其在骨软骨组织工程中的应用66-74
• 参考文献71-74
• 致谢74-75
• 个人简历75

【参考文献】

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本文编号：394606