原花青素交联弹性蛋白的性能研究

发布时间：2017-07-01 05:14

  本文关键词：原花青素交联弹性蛋白的性能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目前,心血管疾病的发病率和致死率在所有疾病中位列第一,因此对用于心血管疾病治疗的人工心脏瓣膜和血管替代品的需求很大。临床上采用戊二醛(Glutaraldehyde, GA)作为交联剂制备得到的心脏瓣膜以及血管虽然具有一定的抗菌、抗炎功能。但是也存在一些严重的缺陷,例如：柔软程度不够,容易钙化和不易再细胞化等。因此,迫切需要寻找新的交联方法以克服GA交联所造成的缺点。 原花青素(procyanidins, PC)是红酒、水果和蔬菜中的黄酮类多酚,具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗血栓等功效。此外,与一些有毒的化学交联剂相比,PC没有急性和亚急性毒性,其体内代谢途径清楚。前期本实验室己证明PC通过多酚羟基与脱细胞心脏瓣膜ECM的脯氨酸之间形成氢键交联,并且在1mg/mL时就能够有效抑制瓣膜ECM钙化。研究显示pH中性环境下,PC既能与弹性蛋白结合又能与胶原蛋白结合形成氢键,随着pH值的下降,其逐渐转向主要与弹性蛋白的结合。而弹性蛋白又是脱细胞瓣膜良好弹性的保障,是维持其柔顺性的关键,能够调节内皮细胞的黏附生长以及平滑肌细胞向内长入,也是ECM钙化的起始位点。因此本研究就柔顺性、抗钙化和再细胞化三个主要方面,对PC最佳交联条件进行详细探究,并且针对PC交联纯弹性蛋白的钙化抑制效果、抗钙化机理以及具体作用靶点进行深入探讨。 采用PC在不同酸性条件下交联脱细胞心脏瓣膜,以期寻找最佳交联条件,从而保持脱细胞瓣膜的柔顺度、抑制钙化并同时保持良好的生物相容性。结果显示,pH6.0交联条件下制备的脱细胞心脏瓣膜能够维持瓣膜的天然形态,显示出类似于天然脱细胞瓣膜的柔顺程度及其他力学性能；能有效抑制瓣膜ECM的钙化；具有良好的细胞相容性和抗血栓性能。 采用PC交联纯的弹性蛋白支架,以期明确PC是否能够抑制弹性蛋白所引起的钙化,相应的抗钙化机理以及具体作用靶点。此外也首次探讨了PC交联纯的弹性蛋白的相关生物学特性,用作组织工程带瓣管道的可能性。结果显示,PC能够抑制由弹性蛋白引起的钙化,其抗钙化机制为：PC交联降低了基质材料的免疫原性,抑制巨噬细胞迁入,抑制MMPs和TNF-a的分泌及活性,从而一方面保护弹性蛋白不被MMPs降解,阻断钙化；另一方面,阻断细胞因成骨分化而引起的钙化。另外,PC可以通过与弹性蛋白的阴离子氨基酸基团之间进行更充分的氢键交联,从而封闭弹性蛋白中潜在的钙化成核位点,阻断钙化。PC交联的弹性蛋白支架具备良好的血液相容性、抗血栓和抗炎潜能,满足了组织工程带瓣管道的关键要求。具备利于再细胞化的孔隙结构及孔隙率,为组织工程支架,特别是带瓣管道提供了良好的选择。 在上述基础上,采用PC在不同pH条件下交联弹性蛋白,以既能抗钙化,又能使弹性蛋白保持柔软为指标,筛选PC对弹性蛋白的最佳交联条件,从而制备出具有理想柔顺度和生物学性能的组织工程支架。结果显示,1mg/mL PC在弱酸性条件下(pH6.0)能够更充分地交联弹性蛋白组分,获得更优柔顺度的弹性蛋白支架,该支架具有快速再细胞化潜能,良好的血液相容性以及抗钙化性能。
【关键词】：原花青素 弹性蛋白 交联 柔顺性 再细胞化 抗钙化
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 第一章 原花青素在酸性条件下交联制备脱细胞心脏瓣膜的柔顺度、抗钙化及相容性15-36
• 引言15-16
• 1 材料与试剂16-17
• 1.1 材料16
• 1.2 试剂16-17
• 1.3 仪器17
• 2 实验方法17-21
• 2.1 脱细胞心脏瓣膜的制备及PC交联17-18
• 2.2 柔顺度测定18
• 2.2.1 交联脱细胞瓣膜的宏观形貌和弯曲角(a)的统计分析18
• 2.2.2 拉伸强度和弹性模量测定18
• 2.3 体外抗钙化能力测定18-19
• 2.3.1 扫描电镜下能谱测定18-19
• 2.3.2 电感耦合等离子体原子发射光谱定量测定钙磷含量19
• 2.4 交联脱细胞瓣膜的生物相容性检测19-21
• 2.4.1 Ⅱ型胶原蛋白酶体外降解实验19
• 2.4.2 细胞黏附实验19-20
• 2.4.3 血液相容性测定20-21
• 2.5 统计分析21
• 3 实验结果21-28
• 3.1 脱细胞及交联后瓣膜的宏观形貌和柔顺度21-24
• 3.2 交联脱细胞瓣膜的体外抗钙化能力24-25
• 3.3 交联脱细胞瓣膜的生物相容性25-28
• 3.3.1 体外Ⅱ型胶原蛋白酶降解稳定性25-26
• 3.3.2 瓣膜间质细胞黏附26-27
• 3.3.3 血液相容性27-28
• 4 讨论28-31
• 5 结论31-32
• 参考文献32-36
• 第二章 原花青素交联弹性蛋白：抗钙化及相关生物学性能36-69
• 引言36-37
• 1 材料与试剂37-39
• 1.1 材料37
• 1.2 试剂37-38
• 1.3 仪器38-39
• 2 实验方法39-45
• 2.1 主动脉弹性蛋白的制备39
• 2.2 组织学分析以及扫描电镜(SEM)观察39-40
• 2.3 PC交联40
• 2.4 交联弹性蛋白支架的孔隙率及孔径分布测定40
• 2.5 抗钙化及其机理研究40-43
• 2.5.1 体内抗钙化能力测定40-41
• 2.5.2 体外巨噬细胞黏附及TNF-α分泌41
• 2.5.3 MMP-12免疫组化染色41-42
• 2.5.4 抗弹性蛋白酶(MMP-12)体外降解42
• 2.5.5 体外钙盐沉积测定42-43
• 2.6 细胞相容性43
• 2.6.1 体外细胞黏附43
• 2.6.2 体内再细胞化43
• 2.7 血液相容性43-44
• 2.7.1 抗凝血实验43-44
• 2.7.2 血小板黏附实验44
• 2.7.3 溶血实验44
• 2.8 统计分析44-45
• 3 实验结果45-59
• 3.1 交联主动脉弹性蛋白形貌及孔隙率、孔径分布45-47
• 3.2 交联主动脉弹性蛋白抗钙化及其机理47-54
• 3.2.1 体内抗钙化能力测定47-49
• 3.2.2 抗巨噬细胞黏附及TNF-a分泌49-51
• 3.2.3 抗MMP-12分泌51-52
• 3.2.4 抗弹性蛋白酶(MMP-12)体外降解52
• 3.2.5 体外钙化分析52-54
• 3.3 细胞相容性54-56
• 3.3.1 体外细胞黏附54-55
• 3.3.2 体内再细胞化55-56
• 3.4 血液相容性56-59
• 3.4.1 抗凝血实验56-57
• 3.4.2 血小板黏附实验57-58
• 3.4.3 溶血实验58-59
• 4 讨论59-63
• 5 结论63-64
• 参考文献64-69
• 第三章 不同PH条件下原花青素交联弹性蛋白支架的研究69-95
• 引言69-70
• 1 材料与试剂70-72
• 1.1 材料70
• 1.2 试剂70-71
• 1.3 仪器71-72
• 2 实验方法72-75
• 2.1 主动脉弹性蛋白支架的制备及形貌分析72
• 2.2 PC交联72
• 2.3 弹性模量及柔顺度测定72-73
• 2.4 交联稳定性测试73
• 2.5 细胞相容性73-74
• 2.5.1 体外细胞黏附73
• 2.5.2 体内再细胞化73-74
• 2.6 血液相容性74
• 2.7 体内外抗钙化能力分析74-75
• 2.7.1 体内抗钙化能力测定74
• 2.7.2 体外抗钙化能力测定74-75
• 2.8 统计分析75
• 3 实验结果75-88
• 3.1 交联主动脉弹性蛋白的微观形貌75-76
• 3.2 PH值对交联弹性蛋白弹性模量的影响76-77
• 3.3 PC交联稳定性77-78
• 3.4 细胞相容性78-82
• 3.4.1 体外细胞黏附78-81
• 3.4.2 体内再细胞化81-82
• 3.5 血液相容性82-84
• 3.6 体内外抗钙化能力分析84-88
• 3.6.1 体内抗钙化效应84-86
• 3.6.2 体外抗钙化效应86-88
• 4 讨论88-90
• 5 结论90-91
• 参考文献91-95
• 第四章 文献综述95-110
• 参考文献100-110
• 附录110-111
• 致谢111-112

【共引文献】

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