人参皂苷Rh-2抑制口腔鳞癌细胞增殖、侵袭及转移的研究
发布时间：2014-10-09 19:56
【摘要】 目的：观察人参皂苷Rh2对口腔鳞癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响,并初步阐明其分子机制。方法：采用MTT比色法观察人参皂苷Rh2(G-Rh2)对口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)细胞系kb细胞增殖的影响；采用流式细胞仪和Hoechest染色法分别检测G-Rh2对Kb细胞凋亡的影响；采用Transwell小室内Matrigel胶重建基底膜实验观察G-Rh2对Kb细胞侵袭能力的影响；采用划痕实验观察G-Rh2对Kb细胞体外迁移能力的影响；采用明胶酶谱法检测G-Rh2对Kb细胞MMP-2表达的影响；采用细胞内活性氧荧光探针DCFH-DA检测G-Rh2对Kb细胞胞内活性氧水平的影响；采用ELESE试剂盒检测G-Rh2对kb细胞内VEGF水平的影响。结果：(1)人参皂苷Rh-210、20、40、60、80μg/mL时,对Kb细胞的生长抑制率分别为16.4%、21.2%、28.1%、30.2%、31.8%;10、20、40μg/mL G-Rh2处理后侵袭细胞数分别降低到65.4%,43.2%,16.9%(P<0.01)；划痕愈合度分别为19.5%,10.5%,8.8%,对Kb细胞的迁移有明显的抑制作用。(2)人参皂苷Rh-2对Kb细胞中MMP-2表达的抑制作用较明显,浓度在40μg/ml时几乎可完全抑制；人参皂苷Rh-2可清除Kb细胞内产生的活性氧,抑制Kb细胞分泌VEGF,从而抑制肿瘤血管的生成。结论：人参皂苷Rh2作为人参天然活性成分之一,可抑制人口腔鳞癌Kb细胞的增殖、侵袭及转移且呈剂量依赖性,可通过抑制肿瘤细胞分泌基质金属蛋白酶的活性以及抑制血管新生而抑制肿瘤转移。
第一章研究背景
人参是我国传统的宝贵中草药材。此中重要身分是人参皂苷和人参多糖，人参皂苷约占4%。人参的药理活性范畴非常遍及不但对中枢神经、心血管、免疫、内排泄体系具有药理作用，还体现出抗肿瘤、抗应激、抗氧化活性[2'33。本文重要对人参中重要活性身分人参皂甙Rh2的药理作用举行综述。
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1.1人参皂甙Rh2发现
人参皂甙Rh2是从红参中提取的自然活性身分，分子量为622，分子式为C36H6208,化学名为20(S)—人参二醇一3—氧一 0 — D—吡喃葡萄糖苷。1983年，日本学者北川勋初次从朝鲜红参中分散出20 (R)-人参皂苷Rg3和20 (S)-人参皂苷Rg3，而人参阜苷Rh2为20 (R)-人参阜苷Rg3降解产品，研究评释，红参中特有的人参皂昔Rh2在白参中险些没有。这阐明人参皂苷Rg3和Rh2是在白参蒸制成红参的历程中天生的次生皂苷。
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1.2人参皂苷Rh2的抗肿瘤作用
1.2. 1抗肿瘤
肿瘤细胞区别于正常细胞的一个重要特性在于分解停滞，因此，恶性肿瘤被看作是细胞分解非常的疾病。分解非常后，返回原始胚胎细胞表型，即去分解。迩来的研究评释，引起细胞分解阻抑特异性的基因转变在肯定条件下是可逆的，从自然化合物中探求分解诱导剂成为学者们研究的重点细胞凋亡是一个步伐化去世亡的历程，其与肿瘤产生、生长及其对治疗因子的反响干系亲昵。比年来，人们渐渐了解到肿瘤细胞周期停滞、凋亡可克制实体瘤的生长，减轻病灶四周炎症反响，成为恶性肿瘤化疗的新目的。大量研究评释，人参皂甙Rh2抗肿瘤作用与传统的化疗药物有所差别，深入研究的抗肿瘤作用机制具有重要的实际意义。
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第二章人参皂苷Rii-2抗Kb细胞转移作用研究
2.1引言
口腔鳞状细胞癌为常见的口腔恶性肿瘤，生长快，转移率高，本实验选取人口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC)细胞系kb细胞研究对象，采用mr比色法观察不同浓度人参皂苷Rh2 (G-Rh2)作用后对kb细胞增殖的影响；采用Hoechst 33342染色法和流式细胞分析仪检测G-Rh2对Kb细胞凋亡的影响；采用流式细胞分析仪检测G-Rh2对Kb细胞周期的影响；采用Transwell小室内Matrigel胶重建基底膜实验观察G-Rh2对Kb细胞侵袭能力的影响；采用划痕实验观察G-Rh2对Kb细胞体外迁移能力的影响。
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2.2实验材料
2.2.1细胞株
人口腔鳞状细胞癌细胞系Kb细胞，购自中国典型培养物保藏中心（CCTC，武汉）
2.2.2主要试剂
人参皂苷Rh2 中国药品生物制品检定所
RPMI-1640培养基 美国Sigma公司
胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有公司
Hoechst 33342 美国Sigma公司
DMSO 美国Sigma公司
人工重构基底膜材料Matrigel胶 美国BD公司
Transwell小室（孔径Stim) 美国Millipore公司
胰蛋白酶 美国美国Sigma公司
注射用链霉素 山东瑞阳制药有限公司
注射用青霉素钠 山东鲁抗医药股份有限公司
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第三章 人参皂苷RH-2体外抗肿瘤转移的分子机理研究.............. 27-38
3.1 引言..................... 27
3.2 实验材料 .......................27-29
3.3 实验方法 ................................29-33
3.3.1 主要试剂配制 ........................29-31
3.3.2 细胞冻存、复苏................. 31
3.3.3 明胶酶谱分析实验.................... 31
3.3.4 Kb细胞内活性氧检测 ..........................31-32
3.3.5 VEGF蛋白水平的测定 ..............32-33
3.3.6 数据分析......................... 33
3.4 实验结果 ......................33-36
3.4.1 人参皂苷Rh-2对Kb细胞中MMP-2活性的影响 ......................33-34
3.4.2 人参皂苷Rh2对Kb细胞内活性氧的影响 .....................34-35
3.4.3 人参皂苷Rh-2对Kb细胞内血管内皮生长因子(VEGF)的影响 ..................35-36
3.5讨论
基底膜（basement membrane, BM) 和细胞外基质（extraeelhiarmatix，ECM)组成的构造学屏蔽，在肿瘤转移中具有紧张作用，肿瘤细胞能排泄如MMP的卵白酶类可降解这种屏蔽，通过MMP-2降解卵白出现负染条带的面积和亮度来权衡MMP-2的活力。效果表现，人参皂苷Rh-2在20^ig/mL和40^ig/mL G-Rh2组分别低落到52.1%, 50.2%均可克制肿瘤细胞MMP-2的表达量，从而可限定肿瘤细胞突破其构造屏蔽，进一步限定肿瘤细胞在相近构造侵袭。大多数学者证明[5G]，MMP- 2险些可降解细胞外基质的全部身分，与肿瘤的侵袭和转移亲昵相干，并且血管复活在很大水平上又依赖于基质金属卵白酶的活性。肿瘤细胞的快速增生可致使局部缺氧，缺氧情况导致肿瘤细胞大量排泄VEGF并诱导内皮细胞排泄MMP-2，而MMP-2又能上调肿瘤血管内皮生长因子的表达，促进其更有用的和受体联合诱导血管天生，陈卫民[51]等实行MMP-2和VEGF两者相互和谐促进肿瘤的侵袭及转移，从而有用的克制肿瘤细胞的转移。人参皂苷Rh-2大概通过克制MMP-2的表达，从而克制血管天生。
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结论
本论文以人口腔鳞状细胞癌系Kb细胞为研究对象，建立了人参皂苷Rh2抑制空腔鳞癌转移和侵袭的模型，结果表明：
1)人参皂苷Rh-2在实验浓度范围内能抑制kb细胞的增殖，促进其发生凋亡，并对Kb细胞周期有明显影响，使细胞周期停滞于G2 — M期，减少DNA合成和有丝分裂，从而影响细胞周期阻滞和细胞生长抑制。
2)人参皂-苷Rh-2在实验浓度范围内，能够有效抑制口腔鳞癌细胞的迁移、侵袭和肿瘤内部血管新生，在肿瘤转移的多个环节上产生拮抗作用，是一个有效的抗肿瘤转移药物。
3)人参皂苷Rh-2通过清除活性氧，有效改善肿瘤转移相关因子的活性和表达，是其抗肿瘤转移的作用机理之一。
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本文编号：9535
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