基于MT1-MMP抗乳腺癌先导药物筛选与研究

发布时间：2014-12-26 11:45

 

【摘要】 乳腺癌是一种高度异质性的恶性肿瘤,其发病率逐渐上升,且是女性癌症死亡的第二杀手。寻找有效的治疗靶点和适宜的治疗药物,对不同患者采取个体化综合治疗,已成为研究热点。在众多的肿瘤靶蛋白中,膜型Ⅰ基质金属蛋白酶(Membrane type-1matrix metalloproteinase, MT1-MMP)参与肿瘤发生、发展、浸润以及血管生成等多种过程,是一个理想的药物靶点。中医中药有着独特的疗效,广泛用于治疗乳腺癌。分子靶向和中药治疗可望为乳腺癌治疗带来新的前景。本文首先通过计算机辅助药物设计进行靶向MT1-MMP的反义肽筛选和研究,采用分子对接、分子动力学模拟、体外细胞实验等方法,确定反义肽对MT1-MMP和乳腺癌细胞的靶向性；其次,以MT1-MMP为桥梁,探讨药用植物提取液(试剂2号)对MT1-MMP阴、阳性两种乳腺癌细胞株的药效作用与分子作用机制,通过MTT、 AO-EB双染、DNA Ladder、流式细胞、荧光定量PCR (Fluorescence Quantitative PCR, FQ-PCR)、 Western blot等方法,确定试剂2号的药效作用、作用靶点和细胞死亡途径。多序列比对确定了位于MT1-MMP环区的特异序列AYIREGHE(简称MT1-loop),并构建1536条反义肽。通过两轮虚拟筛选,获得了分值较好的5条反义肽。将五条反义肽与其他MMPs成员进行分子对接,发现反义肽FVTFPYIR特异性更好；随后分子动力学模拟结果显示,FVTFPYIR可能影响MT1-MMP的稳定性。在以上的基础上,合成评价最优的反义肽FVTFPYIR进行细胞实验,发现该肽能够对表达MT1-MMP的乳腺癌细胞MDA-MB-231具有较好的抑制作用,同时又有特异亲和力。通过MTT法和形态观察发现,试剂2号能够显著抑制乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞的活力,作用24h的IC50分别为3.45%和2.84%,作用48h的IC50分别为2.36%和2.32%,形态上也发生明显改变,具有时间-剂量依赖关系。在此基础上,进一步通过琼脂糖凝胶电泳、AO-EB双染和流式细胞,发现3%试剂2号能够诱导乳腺细胞凋亡,同时非凋亡途径也参与了细胞死亡。随后,FQ-PCR结果表明,在MDA-MB-231细胞中,3%试剂2号与阳性对照DOX类似,能够提高MMP2、MMP9、MT1-MMP、 caspase3和caspase8基因的相对表达量；在MCF-7细胞中,3%试剂2号与DOX可提高MMP2、MMP9、caspase8、caspase9、p53和bcl-2基因相对表达量,下调caspase3基因。在蛋白水平上,在MDA-MB-231细胞中,试剂2号上调MT1-MMP和p53蛋白,下调caspase3,对bcl-2表达无影响；在MCF-7细胞中,上调caspase3,下调bcl-2,p53蛋白24h表达下降,48h表达增加。由此可以看出,试剂2号对两株细胞作用方式不尽相同。主要结论：靶向MT1-MMP反义肽可望成为抗肿瘤多肽药物研发的一条有用途径,药用植物提取液(试剂2号)对乳腺癌细胞具有很好的杀伤作用,其作用机制与MT1-MMP、p53、caspase、bcl-2等多种分子表达与抑制有关,进一步的分子作用机理尚有待进一步研究。 

第一章绪论

1.1孰腺癌研究进展
1.1.1孰腺癌现状
1.1.2乳腺癌发病因素
研究发现，多种因素可导致乳腺癌的发病。首先，不能忽视遗传因素的作用。通常情况下家族中有人患过乳腺癌，那么他的直系亲属患乳腺癌概率就比普通人高两到三倍[3]。其次生育因素，未育、晚育以及第一胎足月妊娠大于30岁的人群也易患病。此外，生过孩子不哺乳，同样也会增加乳腺癌发病率。再次是月经因素。月经初潮年龄小于12岁或停经在55岁以后的人群有患病的风险。据报道，月经初潮年龄小于12岁与大于17岁相比，乳腺癌发生的相对危险增加2.2倍。闭经年龄大于55岁比小于45岁者发生乳腺癌的危险性增加1倍。同时，得过乳腺良性疾病的人群也有高发风险，比如乳腺增生，乳腺纤维瘤等。然而专家称，只有小部分乳腺癌的的发病与以上因素有关，更多的是由环境因素造成。己证实环境中有216种化合物与乳腺癌发生有关，如多氯联苯、全氟辛酸、聚氯乙稀等。
1.1.3乳腺癌的分型
根据免疫组化可将乳腺癌分为四个类型，即Luminal A型，Luminal B型，HER2型和Basal型（三阴型）[4]。Luminal A型和Luminal B型均是雌激素受体（EstrogenReceptor, ER)或孕激素受体（Progesterone receptor, PR)呈阳性的，两者的区别是后者的人表皮生子因子受体-2 (Human epidermal growth factor receptor, HER-2)呈阳性；HER2型顾名思义是HER2呈阳性，而ER和PR表达缺失；Basal型是为ER、PR和HER2均为阴性，这类型的乳腺癌恶性程度高、侵袭能力强、预后性差等特点，目前尚无有效的治疗方案。免疫组化分型能够更好地体现乳腺癌的生物学特点，可以判断预后和指导乳腺癌个体化治疗。
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1.2 MT1-MMP与乳腺癌
1.2.1 MMPs 简介
基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs)是一类Zn2+依赖性的多功能内肽酶，它们的作用目标是裂解细胞外基质（Extracellular matrix, ECM)、生长因子、细胞因子、细胞表面相关的點附以及信号受体。通常，它们在胚胎阶段和组织重塑过程中表达，如排卵期、子宫内膜循环和伤口愈合。重要的是它们通常在多种肿瘤中过 ?量表达，被认为是肿瘤转移过程多步骤中的重要成员，同时它们也参与调节细胞增殖、释放生长因子和血管生成等过程[14]。MMPs活性在多个水平上被调控，主要是通过激活酶原和与金属蛋白酶组织内源性抑制剂（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)相互作用。
根据结构特性，MMPs可分为分泌型和膜型MMPs。分泌型MMPs可以扩散并影响远程组织和细胞，相比之下，膜型MMPs局限于表达它的细胞表面，因而只能调节自身附近的蛋白水解活性。
1.2.2 MT1-MMP 特性
膜型 I 基质金属蛋白酶（Membrane type-1 matrix metalloproteinase, MTl-MMP,MMP14)作为首个被鉴别出来的膜型基质金属蛋白酶，直接或间接降解许多ECM大分子，如I、II、m型胶原，层粘连蛋白1和5，纤连蛋白，玻连蛋白，纤维蛋白和聚集蛋白聚糖MT1-MMP具有MMPs成员的典型结构：前肽结构区、催化结构域(catalytic domain, CAT)、铰链结构域和血红素样结构域（hemopexin-like domain,HPX),同时具有跨膜区、胞质尾端以及furin蛋白识别等位点（图1-2)。其中催化结构域是MT1-MMP致癌特性最重要的区域，被认为是恶性肿瘤适宜的药物祀点而成为国内外研究的热点。随着HPX、跨膜胞质区等其他区域作用功能的逐渐阐明，MT1-MMP在整个肿瘤发生、发展中的重要作用被更加确定。
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第二章靶向MT1-MMP反义肽的虚拟筛选及其对乳腺癌细胞的抑制作用

2.1引言
反义肽即DNA反义链编码的多肽，如同DNA正义链和反义链那样，其与正义肽也存在相互作用。目前有Mekler-Idlis (M-I)配对理论、AHBs (反义同源盒）理论和分子识别理论对其作用原理和机制进行了较为详细的描述[73]，其相互作用主要是疏水性、静电引力、氢键。反义肽和正义肽之间特殊的作用模式，己被用于多个领域。罗胜明等[74]研究发现VEGF_C反义肽可抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和转移能力，并且抑制肿瘤组织VECFR-3阳性血管的形成，发挥抗骨肉瘤作用。作为一种新型多肽先导药物来源，反义肽在生物医药等领域具有重要的研发前景。
国内外有大量的 MMPs 抑制剂（matrix metalloproteinase inhibitors, MMPIs)研究报道，但大部分的MMPIs被扼杀在II、III临床阶段，其主要原因是MMPs家族序列同源性高、功能区域三级结构相似，所研发的MMPIs缺乏选择性，以致特异性低和毒副作用大。筛选和获得高选择性的MMPIs己成为该领域研发的关键。本节以MT1-MMP膜表面蛋白为对象，采用生物信息学与基于反义肽理论的虚拟筛选技术，筛选与发现分子靶向MT1-MMP特异区域的结合肽，期望为靶向MT1-MMP抗肿瘤反义肽先导药物的研发提供了一种新的思路与途径。
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2.2实验材料
2.2.1蛋白信息
MMPs 蛋白序列：下载自 NCBI 蛋白数据库()，MMPs 三维结构：下载自 PDB 数据库Oittt)://www.rcsb.org/Txlb/home/home.do)，蛋白序列及三维结构信息见表2-1。
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第三章 试剂2号对乳腺癌细胞MDA-MB-231(MT1-MMP~+)和MCF-7(MT1-MMP~-)作用机理的探讨.......................... 45-76 
3.1 引言................. 45 
3.2 材料 ..........................45-47 
3.2.1 主要仪器 ......................45 
3.2.2 主要试剂 ............................45-46 
3.2.3 主要试剂配制........................ 46-47 
3.3 实验内容 ........................47-55 
3.3.1 气象色谱法测定乙醇含量.................... 47-48 
3.3.2 试剂2号对MCF-7和MDA-MB-231细胞活力的影响..................... 48 
3.3.3 AO-EB细胞双染 ............................48 
3.3.4 电泳检测MCF-7和MDA-MB-231细胞DNA Ladder ..............................48-49 
3.3.5 FCM检测乳腺癌细胞死亡 ........................49-50 
3.3.6 FQ-PCR检测试剂2号作用后乳腺癌多基因表达变化 ...............50-53 
3.3.7 Western Blot检测乳腺癌细胞相关蛋白的表达.............. 53-55 
3.4 实验结果与分析...................... 55-71 
3.4.1 乙醇含量测定 .......................55-57 
3.4.2 试剂2号抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞活力 ..................57-63 
3.4.3 AO-EB荧光双染结果 .............................63 
3.4.4 试剂2号作用MCF-7和MDA-MB-231细胞后的DNA Ladder ..............................63-64 
3.4.5 FCM检测试剂2号对MCF-7和MDA-MB-231细胞死亡的影响............................... 64-65 
3.4.6 FQ-PCR检测MCF-7和MDA-MB-231细胞多基因表达发生改变 .................65-70 
3.4.7 Western blot实验结果 ........................70-71 
3.5 讨论.................................... 71-74 

3.6 结论

(1)试剂2号对MDA-MB-231和MCF-7细胞增殖具有很好的杀伤作用，均呈现剂量-时间依赖关系；
(2)试剂2号通过凋亡和非凋亡途径调控MDA-MB-231和MCF-7细胞的增殖，非凋亡途径可能起主要作用，需要进一步研究；
(3)试剂2号作用MDA-MB-231和MCF-7细胞靶点方式有相同的如MMP2、MMP9,也有不同的如p53、bcl-2和caspase3等。
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总结

靶向MT1-MMP反义肽可望成为抗肿瘤多肽药物研发的一条有用途径，药用植物提取液（试剂2号）对乳腺癌具有很好的疗效作用，其对乳腺癌细胞杀伤作用与MT1-MMP、p53、caspase家族成员、bcl-2等多种分子表达与抑制有关，进一步的分子作用机理尚有待进一步研宄。全文结论如下：
1.经过两轮虚拟筛选获得了分值较好的五条反义肽；该五条与其他MMPs成员分子对接，发现FVTFPYIR特异性更好；与MT1-MMP分子动力学模拟，初步认为FVTFPYIR可能会影响MT1-MMP的稳定性；
2.体外细胞实验显示，反义肽FVTFPYIR对表达MT1-MMP蛋白的MDA-MB-231和MG-63细胞活力具有较好的抑制作用，同时对MDA-MB-231细胞具有特异的亲和力，呈现剂量和时间依赖关系；
3.试剂2号对MDA-MB-231和MCF-7细胞增殖具有很好的杀伤作用，均呈现剂量-时间依赖关系；试剂2号通过凋亡和非凋亡途径调控MDA-MB-231和MCF-7细胞的活力，非凋亡途径可能起主要作用，笔耕文化传播，需要进一步研宄；
4.试剂2号作用MDA-MB-231和MCF-7细胞靶点方式有相同的如MMP2、MMP9,也有不同的如p53、bcl-2和caspase3等。
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参考文献：

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本文编号：10888