壳聚糖微球增强矿化胶原涂层药物/生长因子承载和释放能力研究及生物学评价
【摘要】 金属植入体涂层除了要求具有高生物学响应性外,还需具有良好的药物/生长因子的承载和释放能力,以期有优良的生物学环境,促进骨形成,从而加快骨整合过程。高生物学响应涂层由于其厚度薄且多孔,会限制药物的承载和产生快速的释放。在本研究中,我们基于矿化胶原薄层具有高生物学响应的特征,利用壳聚糖与药物良好结合力的特点,开展了将壳聚糖微球组装入多孔薄层提高药物承载能力和改善释放行为的研究,进行了生物学评价。主要获得的实验结果总结如下：壳聚糖微球组装增强抗菌药物承载和释放能力的研究：通过电化学沉积技术在钛基板上形成矿化胶原-壳聚糖微球涂层,壳聚糖微球可紧密地粘附在矿化程度较弱的胶原纤维上。由于壳聚糖微球与抗菌药物盐酸万古霉素(VH)有良好的结合力,1h的释放量从65%降低到了37.2%,涂层的爆发性释放得到了有效抑制。在96h后,涂层依仍有药物释放,说明具有较好的缓释性。抗菌实验也证明含VH的矿化胶原-壳聚糖微球涂层在短期和较长期有良好的抗菌效能。壳聚糖微球组装增强生物因子(BMP-2)承载和释放能力的研究：通过电泳注入法,将负载有生长因子rhBMP-2的壳聚糖微球注入到多孔矿化胶原涂层中,其微球存在于矿化胶原涂层的孔壁上。由于壳聚糖微球作用,rhBMP-2的承载量从446ng/cm2提高到了1186ng/cm2,提高了1.7倍。rhBMP-2在涂层中的释放期可达30天以上,显示出良好的缓释特性。由于rhBMP-2承载量有效的提高,体外细胞实验表明前成骨细胞的分化和矿化过程都得到有效地加速,动物体内实验表明8周拔出强度提高了30.16%,并且骨整合过程已基本完成。因此,壳聚糖微球在不影响矿化胶原涂层高生物学响应性的基础上可以显著改善其承载和释放的能力,使得矿化胶原涂层获得优良的抗菌和促进骨整合的效果。
第一章绪论
1.1引言
在当代社会中，由于各种原因引起的骨科疾病如各种骨折、骨缺损、感染等困扰着人们，在治疗各种骨科疾病的过程中，硬骨替代材料的应用越来越广泛。据统计，仅在美国，2009年的硬骨替代材料的销售额为15亿美元，并且以每年15%的速度快速增长，而在我国，由于老龄化的加速，骨缺损、骨质疏松等疾病就更加常见，其潜在的市场价值非常巨大。
人工硬骨替代材料主要有金属材料、无机材料和高分子材料等。这些生物医用材料均具有各自的优势，但因各自的缺点在应用时都受到了一定的限制。随着骨组织工程的不断发展，人们对人工骨替代材料的要求越来越高。一般在理想情况下，用于承力的人工骨替代材料应具备以下要求：一定的机械强度，能承受并传递负载；优良的生物活性和生物相容性；良好的骨引导活性即骨诱导性和骨传导性；植入手术后无感染、炎症或其他并发症产生等。
硬骨替代材料经常被用作固定或替代骨折后长久不能愈合的长骨、调整和稳定骨折或者畸形的脊柱以及关节置换等。这些骨器械的首要目的是在病变或缺损的骨组织在受力时提供物理稳定性。通过此种方法，植入体可以帮助减轻病变或缺损部位的病痛，并尽早恢复其功能性⑴。
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1.2医用钬及钬合金植入体的表面改性
1.2.1医用钬及钬合金
由于创伤、肿瘤切除、感染、骨质疏松等病例越来越多的出现，寻找合适的修复材料，成为生物材料研究的热点之一。在进行硬组织（如骨路、关节、牙齿）修复时，要求替代材料能承受或传递负载。医用金属材料由于具有高机械强度和抗疲劳性能而成为临床应用最广泛的植入材料，在骨支撑修复手术中起到无可替代的作用[2]，已经用于临床的医用金属材料主要有医用不锈钢、钻基合金、钬及钬基合金等。
第二次世界大战后，由于航天与军事工业发展的迫切需要，钛及其合金的制备工艺有了很大的进步。纯度的提高以及性能的改善使钬逐步在外科手术和齿科上得到应用。作为生物医用材料，与常用的不锈钢和钻基合金相比，铁及其合金具有低的模量、良好生物相容性和抗腐姓性等优点，因而在医学上的应用逐渐获得了推广，巳被广泛地应用于硬组织替换、心脏瓣族、血管支架以及各种矫形器械等。
1.2.2医用钬及钬合金的表面改性现状
虽然金属钕及铁合金备受关注并在植入体手术中巳经得到了广泛地应用，但其与人体组织结构差异很大，且表面是化学惰性的[4]，而人体骨组织与钬及钬植入体的相互作用一般发生在两者相接处的界面处，因此这个界面的性能直接决定了植入体手术能否成功。研究表明，植入体表面物理性质和化学性质对生物材料的性能共同起着决定性的作用[5]，对种植体表面进行合适改性，有利于人体骨组织与植入体形成化学键合。
研究表明，通过对植入体进行表面改性处理，可以提高其生物活性改性的方法主要有物理表面改性和化学表面改性。物理表面改性主要是通过表面腐蚀、等离子体轰击等方式改变金属植入体表面的形貌、粗糙度等来促进植入体表面对于蛋白、细胞等的枯附性能，从而影响细胞在表面的生存状态。化学表面改性主要是在植入体表面通过溶胶凝胶、电化学等手段改变植入体表面制备一层生物活性涂层[8]，使宿主组织可以和植入体形成骨性键合。
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第二章实验与测试
2.1实验原料
本实验所釆用的主要试剂如表2-1所示。
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2.2实验方法
2.2.1钬基板和钬棒的表面处理
本实验釆用的基板为市售的Ti片或Ti棒（3x22imn)(纯度>99.99%)，预处理后用于电化学沉积。首先将Ti片用金属切割机切割成20x10x0.1 mm3的片状，不平的边缘经打磨平整后用无水乙醇超声20min清除表面油污。再用去离子水清洗后将Ti片作酸处理和碱处理。
Ti片的酸处理所用试剂为2.75 MHF和3.94 M HNO3的混酸溶液。将Ti片放入适量的混酸溶液中，待反应完成无气泡产生后取出Ti片，并清洗其表面残余混酸溶液。酸处理可以进一步去除Ti片表面油污，同时可去除表面因暴露于空气而形成的氧化层。上述操作均在通风橱内进行。
酸处理后进行碱热处理。将酸处理好的Ti片浸泡于5M的NaOH浓溶液中，置于60 °(：的恒温箱中保温24小时后取出，再用去离子水冲洗以去除表面残余NaOH。将完成碱处理的Ti片干燥后置于马弗炉中于500°C条件下保温2小时，并随炉冷却。碱热处理可以使Ti片表面形成一层多孔Ti02层。该氧化层有利于矿化肢原涂层的沉积，同时Ti基板表面矿化胶原涂层在体内降解后可作为生物活性层进一步发挥骨整合的作用。
2.2.2 矿化胶原涂层的制备
2.2.2.1电解液的配制
将I型胶原牛跟腱酶解在0.005M的醋酸溶液中，室温搅拌5h后得到0.5mg/ml的胶原溶液，放置于4°C的冰箱中备用。
Ca(N03)2和NH4H2PO4作为电解液转碟元素的来源，将Ca(N03)2*4H20和NH4H2PO4分别溶于去离子水制备得到80 mM Ca(N03)2溶液和160 mMNH4H2PO4溶液，作为转碟先驱体溶液。
将上述制备得到的Ca(N03)2、NH4H2PO4和胶原溶液按照体积比1:1:8混合得到最终的电解液，在磁力条件揽拌下，用浓度为0.25M的NaOH溶液将其pH调整至4.3"4.5。最后在电解液中加入适量H2O2改变阴极反应类型以调节阴极附近pH大小。
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第三章 共沉积法制备承载VH涂层及其性能表征................... 37-49
3.1 涂层制备及其形貌成分分析................................ 37-40
3.2 涂层的细胞相容性........................... 40-42
3.3 涂层抗菌药物释放行为.............................. 42-43
3.4 涂层抗菌药物释放行为的动力学分析.................... 43-44
3.5 涂层抗菌效能的评价......................... 44-47
3.6 本章小结................................. 47-49
第四章 电泳注入法制备承载rhBMP-2涂层及其性能表征
4.1涂层制备及其形貌成分分析
通过第三章中电化学共沉积的探索发现，虽然共沉积的方法可以将壳聚糖微球和胶原纤维紧密地结合在一起，并在钬基板上形成一层矿化胶原-壳聚糖微球涂层，但是在共沉积过程中，壳聚糖微球会影响到胶原纤维的矿化过程，在实验过程中也发现，共沉积法制备的涂层偏薄，而且针对rhBMP-2主要作用在前骨细胞分化阶段的特点，需要设计出一种更适合承载rhBMP-2的结构。
针对共沉积涂层可能影响胶原的矿化这一问题，可以釆用先行沉积出不含有微球的扩化胶原涂层，再将载有rhBMP-2的壳聚糖微球注入到多孔的矿化胶原涂层中的做法。可以采用的两个方法是1.将矿化胶原涂层浸泡到壳聚糖徵球溶液中。2.通过调整壳聚糖溶液的:pH值，使壳聚糖微球带电，再采用电化学的方法，将黴球电、泳注入进矿化胶原涂层。
图4.1为以下沉积条件下所获得的涂层形貌：电解液为4 mMCa2+，8 mMPO4'", 0.4 mg/mL胶原，电解液pH为4.5，沉积温度为37°C,沉积时间为30min，沉积电压为2.1V。沉积完成后，自然风干。将涂层浸泡在壳聚糖徵球浓度为0.12mg/ml溶液中3h，即得到图4.1(a)的形貌。将涂层浸入壳聚糖黴球浓度为0.12mg/ml溶液中，利用电化学工作站加载0.5V的电压沉积3h，即可得图4.10)所示的形貌。从图中可以得出，通过浸泡法得到的矿化胶原-壳聚糖黴球涂层，壳聚糖微球停留在5广化胶原涂层表面，且微球出现了团聚的状况，该种结构不利于rhBMP-2深入分布到矿化胶原涂层内部。通过电泳注入的方式，微球分散均句，进入到了矿化胶原涂层的孔洞当中且紧贴孔壁，该种结构利于rhBMP-2深入分布于"化胶原涂层内部，可为提高rhBMP-2承载量，优化rhBMP-2释放曲线打下结构基础。
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结论
本文通过金属植入体表面的矿化胶原涂层有着良好的生物相容性出发，针对其承载/释放抗菌药物及生长因子效能不够理想的现状，利用壳聚糖微球丰富的旁侧基团，较大的比表面积以及良好的生物相容性，对f化胶原涂层进行表面改性，以期在保留矿化股原涂层良好生物相容性的基础上提高其载药/BMP及释药/BMP的性能，从而延长矿化腔原涂层的有效抗菌时间及提高其促进骨整合的性能。同时利用数学模型对释药/BMP的行为进行分析。本文主要研究内容及结论如下：
1.通过电化学共沉积碟酸钱、胶原、壳聚糖微球的方式，利用壳聚糖微球丰富的旁侧基团(-NH2、-COOH)及其合适的粒径大小(几十纳来到几百纳来)，壳聚糖微球可以有效地嵌入到矿化胶原涂层网络中，而且其与裸露的胶原结合牢固。通过电泳注入的方式，壳聚糖徵球也可以被组装入矿化胶原涂层中去，并在矿化胶原的孔洞中大量存在。这两种在矿化胶原涂层中嵌入壳聚糖徵球的方式降低了矿化胶原涂层的孔隙率，提高了矿化胶原涂层孔径的曲折度，而且两种制备矿化胶原/壳聚糖徼球的方式都不会改变矿化胶原涂层的相组成。
2.通过共沉积的方式制备的f化胶原/壳聚糖微球涂层在维持矿化胶原涂层良好相容性的同时可以优化药物释放曲线,减缓药物的初期的"爆发性”释放。通过电泳注入制备的矿化胶原/壳聚糖徵球涂层可以显著提高rliBMP-2的承载量，单位面积承载量达到1186iig/cm2，是不含微球涂层承载量的2.7倍，而且f化胶原/壳聚糖徵球涂层显著减缓了 rhBMP-2的初期“爆发性”释放，使持续释放天数迖到了 30天以上。
3.通过共沉积法制备的矿化胶原/壳聚糖微球涂层由于减缓了药物的爆发性释放，在不影响矿化胶原涂层良好相容性的基础上增长了植入体表面的有效抗菌时间。通过电泳注入法制备的矿化胶原/壳聚糖微球涂层由于rhBMP-2承载量的提高，使表面细胞的枯附及增殖、分化、矿化程度得到提高，并最终加速了植入体的骨整合速度，并可以使植入体在植入手术8周之后基本完成骨整合过程。
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本文编号：10937
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