糖皮质激素类药物在不同些别的肝损伤大鼠体内的药动学研究

发布时间：2015-01-09 14:56

 

【摘要】 目的泼尼松(Prednisone, Pred)和甲泼尼龙(Methylprednisolone, MP)是广泛应用于临床的两种糖皮质激素类药物,泼尼松本身没有药理活性,需经肝脏11β-羟基类固醇脱氢酶1(11β-hy droxysteroid dehydrogenase1,11β-HSD1)转化为有活性的泼尼松龙继而发挥作用。临床上对于转氨酶升高的肝功受损的病人医生通常会选择有活性的甲泼尼龙而不选择泼尼松。本课题以四氯化碳致肝损伤大鼠为研究对象,观察肝损伤时泼尼松、泼尼松龙及甲泼尼龙药代动力学参数是否发生变化,探讨肝损伤对Pred、泼尼松龙、MP药动学的影响,评价肝损伤时应用泼尼松和甲泼尼龙是否需要调整剂量,为临床上转氨酶升高病人应用泼尼松、泼尼松龙和甲泼尼龙时的有效性与安全性提供初步的动物试验数据。方法1.肝损伤大鼠模型的建立肝损伤组大鼠腹腔注射40%CC14溶液,24h后取血测定血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、白蛋白(A1b)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、总胆红素(TBIL),并对大鼠解剖取肝脏,HE染色行病理学检查,验证肝损伤模型是否成功。2.泼尼松及泼尼松龙在正常及肝损伤大鼠体内的药代动力学实验取24只SD大鼠,雌雄各半,随机分为4组,分别为泼尼松正常组(PS-C组)、泼尼松肝损伤组(PS-Ⅰ组)、泼尼松龙正常组(PL-C组)和泼尼松龙肝损伤组(PL-Ⅰ组),每组6只,雌雄各半。按照“肝损伤大鼠模型的建立”项下方法建立肝损伤模型,24h后各正常组和肝损伤组分别灌胃给予泼尼松或泼尼松龙混悬液(15mg·kg-1),于给药后10min、20min、30min、45min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h取血。采用高效液相色谱法(HPLC)分析测定泼尼松龙的血药浓度。3.甲泼尼龙在正常及肝损伤大鼠体内的药代动力学实验取12只SD大鼠,雌雄各半,随机分为2组,分别为甲泼尼龙正常组(MP-C组)和甲泼尼龙肝损伤组(MP-Ⅰ组),每组6只,雌雄各半。按照“肝损伤大鼠模型的建立”项下的方法建立肝损伤模型,24h后正常组及肝损伤组灌胃给予甲泼尼龙混悬液(25mg·kg-1),于给药后15min30min、45min、1h1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、10h取血。采用高效液相色谱法(HPLC)分析测定甲泼尼龙的血药浓度。4.数据统计及分析对大鼠注射CCl4前后各生化指标进行双侧t检验；采用DAS ver2.0(Drug and Statistics for Windows)程序软件计算药动学参数,对各组主要药动学参数AUC0-t, AUC0-∞、MRT0-t, MRT0-∞、t1/2、Cmax、CL和V进行双侧t验。结果1.肝损伤模型的建立大鼠注射四氯化碳24h后,AST、ALT和TBIL明显升高(P<0.05), Alb.y-GT不变(P>0.05)；病理学检查可见肝损伤大鼠肝组织肝小叶结构保留,局部排列紊乱,中央静脉周围组织轻度水肿,肝细胞索排列尚整齐,肝血窦未见明显充血,切片内未见明确门管区。2.泼尼松龙及甲泼尼龙体内测定方法的方法学考察本实验所建立的泼尼松龙和甲泼尼龙的HPLC测定方法,样品及内标峰形良好,血浆中杂质峰不干扰样品的测定；泼尼松龙40.01027～5.125μg·mL-1范围内线性关系良好,甲泼尼龙在0.03109～1.4805μg·mL-1范围内线性关系良好；精密度、准确度、回收率、稳定性等均符合药动学研究相关测定要求。3.泼尼松药动学参数及其统计学检验结果对肝损伤组与正常对照组进行双侧t检验,泼尼松肝损伤组与正常组(Prednisone-Injury group VS Prednisone-Control group, PS-I组VS PS-C组)相比,泼尼松活性泼尼松龙的各药动学参数均无显著性差异(P>0.05)；肝损伤影响亚组分析：将肝损伤组雄性与正常组雄性(PS-I-♂VS PS-C-(?))大鼠相比,肝损伤组雄性大鼠的泼尼松龙的清除率CL显著下降(26.18±6.182VS40.06±4.736L-h-kg-1, P<0.05),其余各药动学参数均无统计学差异(P>0.05)；将肝损伤组雌性与正常组雌性(PS-I-♀VS Ps-C-♀)大鼠相比,各药动学参数均无统计学差异(P>0.05)；性别影响分析：将正常组内雄性与正常组内雌性(PS-C-♂VS PS-C-♀)大鼠比较,正常组内雄性大鼠的药动学参数CL、V显著增大(P<0.05),AUCo. t.AUC0-∞、Cmax显著减小(P<0.05),MRT0-∞、t1/2显著缩短(P<0.05)；将损伤组内雄性与损伤组内雌性(PS-I-♂VS PS-I-♀)大鼠比较,损伤组内雄性大鼠的药动学参数CL、V显著增大(P<0.05),AUC0-t.AUC0-∞、Cmax显著减小(P<0.05),MRT0-∞、t1/2显著缩短(P<0.05),MRT0-t、Tmax无统计学差异。4.泼尼松龙药动学参数及其统计学检验结果泼尼松龙肝损伤组与正常组(Prednisolone-Injury group VS Prednisolone-Control group,PL-I组VS PL-C组)比较,各药代动力学参数均无显著性差异；肝损伤影响亚族分析：将泼尼松龙肝损伤组雄性与正常组雄性(PL-I-♂VS PL-C-♂),泼尼松龙肝损伤组雌性与正常组雌性(PL-I-♀VS PL-C-♀)大鼠相比,各药动学参数均无显著性差异(P>0.05)；性别影响分析：将正常组内雄性与正常组内雌性(PL-C-♂VS PL-C-♀性)大鼠比较,各药动学参数无显著性差异(P>0.05),将肝损伤组内雄性与肝损伤组内雌性(PL-I-♂VS PL-I-♀)大鼠比较,肝损伤组内雄性大鼠的药动学参数CL明显增加(P<0.05),AUC0-∞显著减小(P<0.05),MRT0-t,MRT0-∞、t1/2均显著缩短(P<0.05),其余参数均无显著性差异(P>0.05)。5.甲泼尼龙药动学参数及其统计学检验结果甲泼尼龙肝损伤组与正常组(MP-Injury group VS MP-Control group,MP-I组VS MP-C组)比较,各药代动力学参数均无显著性差异；肝损伤影响亚族分析：将甲泼尼龙肝损伤组雄性与正常组雄性(MP-I-♂VS MP-C-♂)比较,各药动学参数均无统计学差异(P>0.05)；甲泼尼龙肝损伤组雌性与正常组雌性(MP-I-♀VS MP-C-♀)比较,各药动学参数均无统计学差异(P>0.05)；性别影响分析：将正常组内雄性与正常组内雌性(MP-C-♂VS MP-C-♀)大鼠比较,正常组内雄性大鼠的CL、V明显增加(P<0.05),AUC0-∞明显减小(P<0.05),其余药动学参数均无统计学差异(P>0.05)；将肝损伤组内雄性与肝损伤组内雌性(MP-I-♂VS MP-I-♀)大鼠相比,肝损伤组内雄性大鼠的Cmax明显减小(P<0.05),其余药动学参数均无显著性差异(P>0.05)。结论1.本实验建立的CCl4诱导的急性肝损伤大鼠模型稳定,该模型可用于肝损伤对药物代谢影响的研究；2.本实验建立的泼尼松龙和甲泼尼龙体内测定方法专属性强、稳定性好、回收率高,适合泼尼松龙和甲泼尼龙体内血药浓度的测定；3.肝损伤可影响泼尼松在雄性大鼠体内的代谢,使泼尼松的活性代谢产物泼尼松龙的清除率下降,而对于雌性大鼠,肝损伤时其药动学参数未出现显著性改变；肝损伤时泼尼松龙和甲泼尼龙在大鼠体内的药动学参数未出现显著性改变；另外泼尼松、泼尼松龙和甲泼尼龙三种药物在大鼠体内药物代谢动力学存在性别差异。 

前言

糖皮质激素在临床上的应用已有60余年历史了，主要用于抗炎、免疫抑制、抗毒和抗休克，涉及多个临床科室⑴。糖皮质激素属于留体类化合物，为类固醇激素。内源性糖皮质激素是由肾上腺皮质分泌的，包括氢化可的松和可的松，糖皮质激素类药物根据作用时间可分为短效药物（作用8?12h，包括氧化可的松、可的松）；中效药物（作用12~36h，包括强的松（拨尼松）强的松龙（拨尼松龙）、甲强龙（甲拨尼龙）等）；长效药物（作用36~54h，包括地塞米松、倍他米松等）。糖皮质激素类药物在临床广泛使用，在临床上具有很重要的地位，同时糖皮质激素药物也具有较多的不良反应[2]，对糖、脂肪和蛋白质的代谢都有影响；另外糖皮质激素也具有一定的盐皮质激素样作用，可影响电解质的代谢，使电解质代谢紊乱；此外糖皮质激素可以减少韩的吸收，促进骨韩分解，其典型的不良反应为骨质疏松；除此以外，使用糖皮质激素会对肾上腺功能产生抑制作用，大剂量长期使用不能骤然停药，否则会出现反跳现象。
泼尼松和甲拨尼龙是临床上常用的两种糖皮质激素类药物，口服生物利用度良好，约为60%~90%，主要在肝脏代谢，经肾脏排泄，但它们在药代动力学方面表现出较大的差异[3]。拨尼松没有药理活性，在体内拨尼松11位酮基经lip-经基类固醇脱氢酶 1 (lip-hydroxysteroid dehydrogenase 1，llp-HSDl)还原为经基（即拨尼松龙）后继而发挥药理活性[4]。拨尼松和拨尼松龙在体内的药动学过程是一种具有可逆代谢和非线性消除的复杂过程[5]。1 ip-经基类固醇脱氢酶在C-11位的氧化还原反应使拨尼松和拨尼松龙相互转化，而在体内代谢过程中，拨尼松向拨尼松龙的转化比较快，而拨尼松龙转化为拨尼松的速度比较慢[6]，因此血梁中拨尼松龙浓度要高于拨尼松[7]。在体内血装中的皮质激素球蛋白（CBG)浓度较白蛋白浓度高，但是拨尼松龙与CBG的亲和力要高于与白蛋白的亲和力，因此在体内拨尼松龙大部分与CBG特异性结合[8，9]，少部分与白蛋白结合。另外拨尼松龙与CBG的结合力为拨尼松的10倍[10]。拨尼松龙在治疗范围内与血菜蛋白的结合呈非线性[11]，其药动学呈高度剂量相关性[12]，表观分布容积(V)和清除率(CL)呈显著剂量依赖性，且随着CL和V下降，血药浓度升高，两种效应形成互补作用导致半衰期ti/2不变。甲拨尼龙与拨尼松龙仅相差6a位甲基，与拨尼松龙不同，甲拨尼龙不与CBG结合，仅与白蛋白结合，并且甲拨尼龙与血装蛋白的结合呈线性，在16?1000 mg剂量范围内药动学均呈非剂量依赖性。甲拨尼龙大剂量静脉注射时药动学过程呈二室模型，口服及小剂量静脉给药时其药动学过程呈一室模型[I3]。
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第一部分肝损伤大鼠模型的建立

本实验通过对大鼠腹腔注射CC14，建立肝损伤大鼠模型，通过测定腹腔注射CC14前后血清中谷草转氨酶（AST)、谷丙转氨酶（ALT)、白蛋白(Alb)、y-GT和总胆红素，并分别取正常和肝损伤大鼠进行解剖，取肝组织观察并行HE染色，观察病理学变化，以验证肝损伤模型是否成功。
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1实验材料
1.1主要仪器
Biofuge Stratos全能台式高速冷冻离心机美国Thermo Fisher公司
Spectra Max 190 酶标仪 美国 Molecular Devices 公司
紫外分光光度计（930-UVIKON) 美国KONTRON公司
1.2主要试剂
肝素钠注射液 上海信谊药厂有限公司，批号11111
CCU 国药集团化学试剂有限，批号20130120
玉米油 市售玉米油
谷丙转氨酶测定试剂盒南京建成生物工程研究所，批号20130306，20130907
谷草转氨酶测定试剂盒南京建成生物工程研究所，批号20130328，20130927
白蛋白测定试剂盒 南京建成生物工程研究所，批号20130319，20130918Y-GT测定试剂盒 南京建成生物工程研究所，批号20121209，20130910
总胆红素测定试剂盒 南京建成生物工程研究所，批号20130330，20130929
13实验动物
SPF级别SD大鼠，体质量250-280g，笔耕文化传播，雌雄各半，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物合格证号SCXK (京）2009-0004。
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第二部分 泼尼松及泼尼松龙在肝损伤大鼠体内的药动学研究............ 33-55 
1 实验材料............................. 33-34 
1.1 主要仪器............................ 33 
1.2 主要试剂 ..................33-34 
1.3 实验动物............... 34 
2 实验方法................... 34-42 
2.1 泼尼松龙体内测定方法的建立........................... 34-41 
2.1.1 泼尼松龙与内标(卡马西平)对照品溶液的配制 ...............34-35 
2.1.2 色谱条件...................................... 35 
2.1.3 血浆样品的处理 ....................35 
2.1.4 方法的专属性.................... 35-36 
2.1.5 标准曲线的建立............... 36-37 
2.1.6 定量下限的测定................... 37 
2.1.7 精密度试验 .........................37-38 
2.1.8 回收率实验..................... 38-40 
2.1.9 血浆样本稳定性考察 ........................40-41 
2.2 药动学实验........................... 41-42 
2.2.1 实验方案 ........................41-42 
2.2.2 药动学参数计算及统计分析..................... 42 
3 结果 ...............................42-49 
3.1 HPLC方法学验证......................... 42 
3.2 泼尼松龙血药浓度-时间曲线 .....................42-43 
3.3 药代动力学参数及统计结果.................. 43-49 
3.3.1 给予泼尼松的结果 ......................................43-46 
3.3.2 给予泼尼松龙的结果 ................46-49 
4 讨论 ...................................49-54 
4.1 实验动物性别的选择.................... 49 
4.2 给药时间的选择................ 49-50 
4.3 测定指标的选择............................... 50 
4.4 HPLC方法的建立.................... 50-51 
4.5 肝损伤对药动学参数的影响 .....................51-52 
4.6 泼尼松及泼尼松龙代谢的性别差异 ...............52-54 
4.7 实验局限性 ...............................54 
5 结论.............................. 54-55 

第三部分 甲泼尼龙在肝损伤大鼠体内的药动学研究

本实验通过建立高效液相色谱法（HPLC)测定大鼠血奖中的甲拨尼龙，研究甲拨尼龙在肝损伤模型大鼠体内旳药代动力学与正常对照组相比是否发生变化，用以推测肝损伤时使用甲拨尼龙是否需要调整给药方案，为临床上肝功能受损的病人应用甲拨尼龙时的有效性与安全性提供初步的动物试验数据。
1实验材料
1.1主要仪器
Biofiige Stratos全能台式高速冷冻离心机美国Thermo Fisher公司
930-UVIKON紫外分光光度计 美国KONTRON公司
HHW-420恒温水浴箱 金坛市双捷实验仪器厂
Waters 515型高效液相色谱仪 美国Waters公司
MODEL 500型Lab Alliance检测器 美国SSI公司
CPA225D型电子天平 德国Sartorius公司
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结论

本文釆用ccu诱导形成肝损伤大鼠模型，系统地对肝损伤时拨尼松、拨尼松龙和甲拨尼龙三种药物进行药代动力学研究，通过与正常大鼠比较，观察肝损伤对拨尼松、拨尼松龙和甲拨尼龙药代动力学的影响，探讨肝损伤时对于拨尼松、拨尼松龙和甲拨尼龙三种药物的临床选择，以期为泼尼松、拨尼松龙和甲拨尼龙在临床上的合理应用提供初步的动物实验数据，提高临床用药的有效性和安全性。
全文所得结论如下：
1.本实验建立的ccu诱导的急性肝损伤大鼠模型稳定，该模型可用于肝损伤对药物代谢影响的研究；
2.本实验建立的拨尼松龙和甲拨尼龙体内测定方法专属性强、稳定性好、回收率高，适合拨尼松龙和甲拨尼龙体内血药浓度的测定；
3.肝损伤可影响拨尼松在雄性大鼠体内的代谢，使拨尼松的活性代谢产物拨尼松龙的清除率下降，而对于雌性大鼠，肝损伤时其药动学参数未出现显著性改变；肝损伤时拨尼松龙和甲泼尼龙在大鼠体内的药动学参数未出现显著性改变；另外拨尼松、拨尼松龙和甲拨尼龙三种药物在大鼠体内药物代谢动力学存在性别差异。
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参考文献:

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[2] 乔靖怡,周璐,金若敏,姚广涛.  四氯化碳致大鼠肝损伤早期血清总胆汁酸、α-谷胱甘肽S转移酶、嘌呤核苷磷酸化酶和鸟氨酸氨基甲酰转移酶的变化[J]. 中国药理学与毒理学杂志. 2013(04)
[3] 陈敏玲,张顺国.  HPLC法测定豚鼠外淋巴液和血浆中甲泼尼龙的含量[J]. 中国临床药学杂志. 2011(01)
[4] 王炜,廖林川,侯艳,颜有仪,杨林,粟贵.  HPLC同时测定血液与尿液中的泼尼松和泼尼松龙[J]. 华西药学杂志. 2009(03)
[5] 付春梅,刘三康,李章万.  RP-HPLC测定泼尼松龙的原料和片剂中有关物质[J]. 华西药学杂志. 2006(04)
[6] 周瑾,梅其柄,周四元,李平,程建峰.  反相高效液相色谱法测定生物介质中泼尼松龙及泼尼松龙琥珀酸半酯[J]. 中国药房. 2002(08)
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[9] 黄炎.  长期应用糖皮质激素的毒副作用[J]. 中国实用儿科杂志. 2000(01)



本文编号：11074