桑白皮有效部位提取纯化工艺、质控及药效学研究

发布时间：2015-01-09 11:09

 

【摘要】 桑白皮(Cortex Mori)是桑科桑属植物Morus alba L的干燥根皮。为中国药典收载的常用中药之一,具有泻肺平喘、利水消肿功效。现代药理研究表明,桑白皮降糖降脂主要药效成分为桑白皮黄酮、生物碱及多糖类成分。本课题选用桑白皮进行研究,以期进一步揭示桑白皮药理作用物质基础,为有效部位的研究和新制剂的开发提供方法与依据。本文在综述了桑白皮国内外研究现状的基础上,进行了桑白皮的质量控制；桑白皮有效部位的提取纯化工艺；桑白皮有效部位的质控及初步药效研究。1.桑白皮的含量测定研究采用紫外分光光度法和高效液相法,以桑根酮C、D、DNJ、葡萄糖为对照,测定提取物中总黄酮、总生物碱、总多糖、桑根酮C、D、DNJ的含量。2.桑白皮提取纯化工艺的研究本研究优化了桑白皮黄酮、生物碱及多糖的同步提取工艺,通过单因素考察,确立了最佳的提取工艺。纯化工艺在串联的高压大孔树脂和离子交换树脂的基础上,采用同步提取、稀醇上样及分别洗脱对桑白皮总黄酮、总生物碱及总多糖进行精制纯化。通过对各个影响因素的考察,得到最佳的纯化工艺：将高压PIPO-01大孔树脂和001×7型阳离子交换树脂柱串联,原药液经浓缩后,上样液浓度为0.12g/mL,上样量(树脂与上样药材量比值)为1倍量,8BV水洗脱后,分别用8BV80%乙醇洗脱大孔树脂柱,6BV0.5moL/L氨水洗脱离子交换树脂柱。收集70%乙醇部分,减压浓缩至干,真空干燥,得到的各有效部位的纯度在50.0%以上。3.桑白皮有效部位质量标准研究经过对桑白皮有效部位的提取、纯化,初步建立了以桑根酮D、DNJ及葡萄糖为对照品的桑白皮有效部位TLC鉴别方法；并建立了桑白皮总黄酮、总生物碱及总多糖UV含量测定方法和桑根酮C、D、DNJ的HPLC法含量测定方法,初步建立有效部位的质量标准。4.桑白皮药材不同部位降血糖初步研究采用高脂饲料和STZ诱导小鼠形成2型糖尿病模型的方法,对桑白皮不同部位的降糖药理作用进行了初步探讨,结果表明有效部位具有一定的降血糖作用。 

引 言

桑白皮（Cortex Mori)是桑科桑属植物Morus alba L.的干燥根皮。性甘微苦、寒，归肺经，具有湾肺平喘、利水消肿功能，主治肺热喘咳、水肿胀满尿少、面目肌肤浮肿。民间常用于消炎、利尿、解热、镇咳、怯痰等。始载于《神农本草经》，列为中品，历代本草均有收载。《本草纲目》载：桑白皮主治消渴尿多；南北朝刘宋《雷公炮灸论》认为桑白皮在中药中有独特效用，“是它药不替也”。现代研究表明桑白皮中含有黄酮、生物碱、多糖、香豆素、糖蛋白、挥发油等。药理研宄表明桑白皮具有降血糖、降血压、抗肿瘤、抗炎抑菌、抗病毒等作用。

迄今为止，国内外文献报道的多是桑白皮化学成分的提取分离，或提取物、化学成分的药理研究，制剂及其临床应用方面不多，质量控制方面的研宄较少，2010年版药典中规定了桑白皮的质量标准，但仅收载了一项薄层鉴别，没有含量测定项。对于桑白皮提取物，目前仍未有文献来规定其质量标准。所以需要制定一个比较完善的桑白皮提取物的质量标准。
中草药化学成分提取分离技术发展日新月异，中药有效部位和有效单体的开发也越来越受重视。而中药提取分离制备方法的研究，为进一步探讨中药质量、提高制剂生产、中药的治病机制水平、提高临床疗效提供了前提，也是实现中药现代化的关键。前人研究较多的是桑白皮中生物碱类成分，特别是DNJ分离纯化以及其对a -糖苷酶抑制作用的研宄，对桑白皮中异戊炼基黄酮及多糖成分研究较少。本研宄旨在建立一种简便、经济的方法同时提取分离得到桑白皮的多种活性成分。
采用大孔吸附树脂从中药及其复方中有选择性地吸附其中的有效部分，去除无效部分的提取精制分离技术己较广泛地应用于天然产物的分离，特别是用于黄酮类物质的提取分离。通过阳离子交换树脂离子交换作用，与提取液中生物碱阳离子发生交换吸附，富集纯化桑白皮中含量较低的生物碱类成分，同时将其与多糖类成分有效的分离幵来。本文釆用高压柱将两种树脂柱串联，实现了较常压柱子更快捷、方便的连续分离的方法，提取后的浓缩液依次经过大孔树脂和阳离子树脂，可以同时分离得到黄酮类、多糖类和生物碱类组份。
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第一章研究概况

第一节桑白皮研究概况
桑白皮(^Cortex Mori)是桑科桑属植物Morus alba L的干燥根皮。始载于《神农本草经》，列为中品，历代本草均有收载。桑白皮性甘微苦、寒，归肺经，具有湾肺平喘、利水消肿功能，主治肺热喘咳、水肿胀满尿少、面目肌肤浮肿[']。民间常用于消炎、利尿、解热、镇咳、祛痰等。
1.1桑白皮化学成分
曰本学者Nomura T.在20世纪80年代初领导的研宄小组对桑白皮alba L )化学成分进行了系统的研宄，从中发现了许多结构新颖的Diels-Alder型加合物。迄今为止，国内外研究人员已经从桑属植物中得到百余种新化合物，主要包括异戊稀基黄酮类化合物、Diels-Alder型加合物、多经基生物碱和苗类化合物等。另外，还含有多糖、三蔽、留体、氨基酸和香豆素等化合物。
1.1.1异戊稀基黄酮类成分
异戊稀基黄酮化合物是一大类分布于桑科、豆科和菊科等少数几个科的植物中的天然产物，具有非常明显的化学分类学特征。它们以多方面的生理活性及独特的化学结构引起了国内外药学家的广泛兴趣，异戊稀基黄酮化合物被认为是作为植物防卫素，在植物抵御外来生物的侵袭过程中，它会发挥重要的植物生理调节作用。
研究表明，异戊稀基黄酮类化合物具有多种生物活性，例如，降血压、抗真菌、抗病菌、抗氧化、抗HIV、抗肿瘤等[2”"；黄酮类化合物至少要求有酸经基和一定的亲脂性才认为有生物活性(尤其是抗微生物的活性)的，学术界普遍这样认为。据NikaidoT.等报道，异戊稀基的存在，使得黄酮类化合物中亲脂性极大的增长，强烈的亲和生物膜性，进而使得相关生物活性显著提高["]。由于异戊稀基黄酮类化合物在药理研宄中表现出多种明显的活性，从20世纪70年代开始，对该类成分的研究也愈来愈引起人们的关注。迄今为止，天然由来的该类化合物已有上千余种。
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第二节2型糖尿病研究概况
2.1糖尿病简介
糖尿病（Diabetes mellitus)通常是指2型糖尿病（Type 2 Diabetes mellitus)。糖尿病可分为1型和2型。1型糖尿病是指：病人胰岛B细胞破坏，引起胰岛素绝对缺乏，有酮症酸中毒倾向的糖尿病。2型糖尿病是指：以胰岛素抵抗为主伴胰岛素分泌不足，或胰岛素分泌不足为主伴或不伴胰岛素抵抗的糖尿病。通常所说的糖尿病通常指2型糖尿病，占DM总数的90%以上[_]。一般意义上认为糖尿病表现为“三多一少”症状，即多饮、多食、多尿、体重减少。但是，II型糖尿病有90%是肥胖者，糖尿病患病率与肥胖的流行、静态生活方式有关，而且与年龄增加呈正相关
。
糖尿病除了自身糖代谢紊乱所带了的危害外，其长期的高血糖还可累及各组织器官而引起一系列大血管及微血管并发症（如心脑血管疾病、肾病变、神经病变等）_，其对人体的危害远远超过了糖尿病本身，在糖尿病患者中，70%的住院费用是用于糖尿病慢性并发症的治疗，所以糖尿病又被称为“百病之源”。在这其中，糖尿病所带来的最直接的危害体现在其对心脏病变的影响。糖尿病心脏病变（DiabeticCardiopathy)临床指糖尿病并发或伴发的心脏病，包括动脉粥样硬化心脏病、糖尿病性心肌病及糖尿病自主神经病变_。心脏病变被称为是糖尿病最严重而突出的问题，约占糖尿病患者死亡原因的80%，其中70%死于糖尿病性冠心病。2004年美国国家胆固醇教育规划发表的第三个成人治疗计划（NCEP ATP III)提出，糖尿病患者10年内发生冠脉事件的风险很高，并将糖尿病列为“冠心病（CHD)的等危症” [95]。据世界卫生组织相关研宄资料统计，1997年糖尿病患者约1.3亿，预计到2025年全球糖尿病患者总数可能达到3亿人。中国是目前糖尿病患者最多的国家之一，糖尿病患病率呈日益增长趋势。因此对2型糖尿病发病机制以及生物祀点的研宄是糖尿病治疗的关键，并成为糖尿病领域的科研热点及难题。
目前研宄认为，胰岛素抵抗和P细胞胰岛素分泌缺陷是2型糖尿病发病的两个主要环节。胰岛素抵抗是2型糖尿病发病环节中的重要组成部分，其发生发展过程贯穿于2型糖尿病发生发展过程中，也是糖尿病早期和主要表现。
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第二章 桑白皮黄酮、生物碱及多糖测定方法研究 ...............21-34 
1.1 仪器与材料 ...........................21 
1.2 方法与结果 ...................21-32 
1.2.1 总黄酮含量测定................. 21-24 
1.2.2 桑根酮C、D含量测定................. 24-27 
1.2.3 总生物碱含量测定.............. 27-28 
1.2.4 1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量测定 .............28-30 
1.2.5 总多糖含量测定 ......................30-32 
1.3 讨论............................. 32-34 
第三章 桑白皮有效部位的同步高效提取纯化工艺研究 ..................34-51 
第一节 桑白皮有效部位的同步高效提取工艺研究.............. 34-39 
1.1 仪器与材料 ............................34 
1.2 方法与结果 .................34-38 
1.3 讨论 ......................38-39 
第二节 桑白皮有效部位的同步高效纯化工艺研究 .................39-49 
2.1 仪器与材料 ...............................39-40 
2.2 方法与结果 ....................40-48 
2.3 .........................讨论 48-49 
第三节 桑白皮有效部位的同步高效提取纯化工艺中试放大研究...................... 49-51 
3.1 仪器与材料 ...........................49 
3.2 方法与结果 ...............49-50 
3.3 讨论................................ 50-51 
第四章 桑白皮有效部位质量标准研究 ...................51-68

第五章 桑白皮不同部位对2型糖尿病小鼠降糖药理作用的研究

本实验以高脂词料加链脲佐菌素（STZ)诱导C57小鼠模型，来探讨桑白皮不同部位对高脂饲料加链脲佐菌素诱导的2型糖尿病小鼠血糖、血脂、低密度脂蛋白、胰岛素的影响，并对其降糖作用机制进行初步探讨。
1. 1试验材料
1.1. 1动物
5周龄雄性C57BL/6N小鼠，体重（19±2) g，SPF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，医学实验动物合格证号为SCXR (京）2012-0001。动物饲养于广州中医药大学实验动物中心SPF级动物房，饲养温度与湿度：20-25°C、40-70%。采用12h:12h昼夜间断照明，笔耕文化传播，动物自由进食、饮水。
1.1.2词料
基础饲料、高脂饲料均由广东省医学实验动物中心提供。高脂饲料配方组成：酷蛋白26.17%，L-胱氨酸0.39%,麦芽糖糊精16. 35%，鹿糖9. 00%，纤维素6. 54%，豆油，3. 27%,猪油 32. 06%,矿物质 AIN-93 4. 58%,维生素 AIN-93 1. 31%,氯化胆碱 0. 33%，胆固醇1. 0%,胆盐0. 15%,合格证号为SCXK(粤)2008-0002。
1.1. 3试剂
桑白皮不同部位，总黄酮、总生物碱及总多糖是将桑白皮经60%醇提后，适当浓缩，上串联大孔树脂及离子交换树脂得到，（由本实验室提供）。总黄酮含量为60% (以桑根酮C计）；总生物碱含量为50% (以1-脱氧野尻霉素DNJ计）；总多糖含量为50%(以葡萄糖计）。
STZ (Sigma,批号：040M1367), 二甲双胍（AladdinChemistry，批号：23195)，肝素钠（江苏万邦生化医药股份有限公司，国药准字H32020612),葡萄糖氧化试剂盒；甘油三酷试剂盒；总胆固醇试剂盒；低密度脂蛋白试剂盒；总胆红素；尿酸（上述试剂盒均有上海荣盛生物药业有限公司，批号分别为：20120801; 20121002； 20120801;20120701； 20121201; 20121201)； 11 0 -类固醇脱氧酶试剂盒（美国R & D，批号分别为：DRE68753; DRE84576)；梓檬酸、梓檬酸钠均为分析纯。
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结语

本文通过查阅国内外文献，并详细分析桑白皮的中医药理论阐述、药学、药理药效及临床等方面的内容，进行了一系列的药学药理学实验研究。
1.1桑白皮含量测定方法旳建立
建立了桑白皮总黄酮、总生物碱及总多糖含量测定方法。其中桑白皮总黄酮含量测定方法中与常用总黄酮含量测定的两种显色方法进行比较，并详细考察盐酸-镁粉显色法。不足之处是没有对总生物碱和总多糖含量测定方法做更深入的考察。
釆用HPLC-UV方法，经色谱条件优化，实现了桑白皮药效成分桑根酮C、D及DNJ含量测定，为控制桑白皮及含有桑白皮的中成药的质量提供方法和依据。
1.2桑白皮有效部位的同步高效提取纯化工艺
以桑白皮中总黄酮、DNJ及总多糖的含量为指标，采用单因素考察优化了提取工艺。以大孔树脂、离子交换树脂富集、纯化桑白皮中总黄酮、总生物碱及总多糖对上样量、洗脱用醇浓度、氨水浓度和用量等进行工艺考察。考察所得工艺参数经重复，证明方法稳定可行。
此工艺的创新之处是实现了桑白皮三个有效部位的同步高效提取，稀醇上样解决了桑白皮异戊稀基黄酮上样难的问题，串联树脂柱分别洗脱得到三个有效部位。
1.3桑白皮有效部位的质量标准的研究
桑白皮有效部位在2010年版中国药典的基础上，做了薄层定性鉴别和总黄酮、总生物碱及总多糖、桑根酮C、D及DNJ含量测定，测定方法重复性强，稳定可行。为桑白皮有效部位的质量标准的制定提供方法和依据。不足之处是生物碱的薄层定性鉴别没有找到合适的展开系统及显色剂。
1.4桑白皮不同部位的降血糖药理作用的研究
本文中采用高脂饲料+STZ诱导的2型糖尿病C57小鼠模型，对桑白皮不同部位的降血糖作用进行了初步探讨，结果表明桑白皮3个部位对2型糖尿病小鼠血糖均有一定的控制作用，其中异戊稀基黄酮类及生物碱成分降糖降脂作用效果较为明显，异戊稀基黄酮类成分对于高脂饲料诱导的高血脂小鼠体重有明显抑制作用，而且黄酮类成分能够降低低密度脂蛋白作用。进一步对桑白皮不同部位降糖作用机制做了初步探讨发现，实验结果不能证明桑白皮不同部位降糖作用是通过抑制肺中11 e-HSDl的水平，有待于进一步的研究。
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参考文献：

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本文编号：11045