中药有效成分分析的新方法新技术研究

发布时间：2016-09-30 11:22

  本文关键词：中药有效成分分析的新方法新技术研究，由笔耕文化传播整理发布。

《复旦大学》 2012年

中药有效成分分析的新方法新技术研究

刘扬  

【摘要】：本论文以寻找中药有效成分为出发点,以色谱、质谱技术为基础,尝试探索中药研究的新方法和新技术。建立了以提取手段、色谱质谱联用技术、基于细胞模型的活性成分筛选技术互相搭配的分离分析手段用于中药有效成分的提取、分离、筛选和鉴定；同时,针对中药复方方剂的配伍比例进行了优化探索,并采取先分解再组合的实验思路建立基于中药复方叠加效应的有效成分筛选方法,并搭建了两维色谱体系用于分离复方中药中的复杂成分,从而实现了在综合考量中药多组分、多靶点、多效应特点上的较为全面的活性物质分离鉴定；此外,以基质辅助激光解吸飞行质谱(MALDI-TOF-MS)为出发点,通过采用新基质成功实现了高通量的中药化合物筛选及长链脂肪酸富集；在此基础上,将MALDI-TOF-MS筛查扩展到了固定酶抑制剂的高通量筛查,从而扩宽了高通量MALDI-TOF-MS技术的筛查范围。相关研究工作及成果的摘要如下： 第一章文献综述部分充分描述了中药的丰富内涵,突出了中药有效成分在中药质量筛查中的重要性,以及探索中药药效机理对于药物筛选与研发的必要性；介绍了色谱技术作为一种现代高效分离工具在中药研究方面的发展与应用；阐述了针对中药有效成分研究的各种提取技术,围绕中药多组分、多靶点、多效应等特点展开的数学实验思考,以及对于中药有效成分筛查的体外生物模型研究方法；同时,详细描述了在化合物分离鉴定方面发挥重要作用的多维色谱、质谱技术,概述了当前应用于中药分离的多维色谱模式以及在中药研究中逐渐展露身手的质谱鉴定技术。从中药的提取预处理、到数学思维综合考量、到多维色谱高效分离、到生物模型科学筛分、到质谱技术高通量鉴定等多种化学生物技术相互结合的方式,对于中药有效成分的分析具有十分重要的意义。通过描述该研究的基本思路和进展状况,阐明了本课题选题及研究的学术意义和技术背景。 第二章将提取、分离、筛选、鉴定技术互相搭配,从而实现对中药有效成分的分离分析。以中药半枝莲为分析样本,探索不同提取方法对于其中有效成分-野黄芩苷的提取效率。通过纳升级的色谱＼质谱联用模式来定性鉴定和定量测量经过红外提取后的半枝莲中的成分野黄芩苷。同时,红外提取的各个过程各个实验参数都进行了优化,从而验证了该提取方法的可靠性及高效性。同时,通过与其他几种提取方法,例如常规的加热回流方法、超声提取方法、微波提取方法等进行比较可知,红外提取能够获得更高的提取效率。同时,中药半枝莲在纳升级色谱质谱联用模式下得到了有效分离。通过参照野黄芩苷标准品的色谱保留时间及质谱结构信息,即可以快速准确的确定半枝莲中野黄芩苷的相关信息,从而实现高效定性鉴定。此外,通过建立野黄芩苷标准曲线从而获得相应的定量信息,进而得到较为满意的方法有效性、线性以及检测限。结果显示,该方法在0.6至20ng mL-1范围内线性良好,相关系数(R2)为0.9973,检测限(LOD)为0.5ng mL-1(S/N=3)。 第三章将中药复方作为分析对象,以探索复方配伍合理性,考量复方药效叠加作用以及分析复方中药复杂组分为出发点,通过提取优化、生物检测细胞模型、两维色谱分离及高效准确质谱鉴定等技术,尝试从更为全面的角度来分析纷繁复杂的中药有效成分。首先,从探究复方方剂的配伍比例合理性出发,针对特定的中药复方方剂(该方剂由三种单味药),在结合细胞生物筛查效果的基础上,进行方剂配伍比例值的优化探索；其次,鉴于中药各个组分之间的药效叠加效应,从整体着眼,根据先分解再组合的思想重新进行细胞增殖生物筛查,进而从更为全面的角度对有效成分进行筛查；然后,以紫杉提取液为实验对象,继续按照先分解再整合的实验思路对其中的有效成分进行筛查,根据实验结果,紫杉醇被确定为其中的有效成分,从而验证了这一筛选方法的有效性；最后,将亲水色谱柱和反相色谱柱相结合,搭建两维色谱分离系统,经过验证,该系统具有更好的正交性和更高的峰容量,继而将此两维色谱分离体系与细胞模型、质谱鉴定相结合,从而实现高通量的药物筛选,对于药物研发及药物筛查具有重要意义。 第四章以基质辅助激光解吸飞行质谱(MALDI-TOF-MS)为出发点,将石墨烯和氧化石墨烯用作MALDI基质,来鉴定传统中药化合物。由于石墨烯和氧化石墨烯的表面积较大,从而避免了MALDI离子源与真空系统的污染。同时,由于石墨烯优异的电学、热学以及机械性能使得MALDI-TOF-MS可以在浓度为100nM时达到稳定的分析,且免除背景噪音干扰。实验采用当归和半枝莲做为检测样本,将当归中的阿魏酸(m/z194)、半枝莲中的野黄芩苷(m/z462)及汉黄芩素(m/z284)作为检测的目标化合物。实验表明,这两种MALDI基质对于中药中组分的不同浓度不具有歧视效果。此外,石墨烯和氧化石墨烯还可以作为样品的吸附剂展示其富集功效,从而使被测物的检测限获得较大幅度的降低。实验表明,这种MALDI-TOF-MS方法具有简单灵敏、快速经济、以及高通量等突出特点,可以为中药快速质量筛查提供新的技术手段。 此外,还将石墨烯和氧化石墨烯用于富集长链脂肪酸。将5种长链脂肪酸,即十二烷酸(C12)、十四烷酸(C14),十六烷酸(C16),十八烷酸(C18)和二十烷酸(C20),用作为代表性样本。由于石墨烯或氧化石墨烯较大的表面积和强烈相互作用,这5种长链脂肪酸被石墨烯和氧化石墨烯有效富集,实现了高通量的检测。同时,本方法还可以成功用于低浓度下检测实际生物样品中的5种长链脂肪酸样本,从而证明了这种MALDI-TOF-MS方法可以实现简单灵敏、快速经济并且高通量的检测长链脂肪酸。 第五章则在上述MALDI-TOF-MS检测技术的基础上,将这种高通量筛查技术用于酶抑制剂的筛选中,该筛选由固定酶磁性碳球和以氧化石墨烯为基质的MALDI-TOF-MS结合完成。首先,将乙酰胆碱酯酶(AChE)固定于3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GLYMO)修饰的磁性碳球上,该固定酶磁性碳球具有高效的酶活性和稳定性,并可以将酶从底物和产物中有效分离出来。固定化乙酰胆碱酯酶AChE的效率则通过固定酶磁性碳球和样品底物之间的反应加以验证,而后续的定量分析底物乙酰胆碱和产物胆碱则通过基于氧化石墨烯为基质的MALDI-TOF-MS方法完成,该MALDI-TOF-MS方法没有背景干扰。乙酰胆碱的检测限LOD是0.25fmol/μL,在0.5至250fmol/μL范围内有良好的线性值(R2=0.9998)。而胆碱则在0.05至15pmol/μL内有很好的线性(R2=0.9994)和低检测限LOD(0.15fmol/μL)。在标准曲线的浓度范围内有良好的准确度和精确度。共有8种化合物(4种已知乙酰胆碱酯酶AChE抑制剂和4种没有乙酰胆碱酯酶AChE抑制效果的对照化合物)用此方法进行验证,所得结果证明该高通量筛分方法可以大大推动日常酶抑制剂筛选的进程。 总体而言,本论文围绕中药有效成分研究为核心,以色谱、质谱技术为基础,着重发展新方法和新技术。首先,建立了包含提取、分离、筛选、鉴定的操作技术方法；其次,围绕中药复方这一复杂体系,着重优化复方配伍比例值,探索基于复方药效叠加作用基础上的有效成分筛选方法,建立两维色谱分离模式以实现更为全面的中药复方分离分析；同时,将MALDI质谱技术成功用于中药分子检测及长链脂肪酸富集,从而为高通量的中药质量筛查提供新的技术基础；最后,固定酶抑制剂的高通量MALDI检测的实现,大大拓宽了该MALDI质谱检测新技术的应用领域,具有极大潜力。本论文以色谱质谱等现代仪器手段为基础,结合生物模型,着重发展中药有效成分分离分析的新方法新技术。以高效灵敏、准确可靠的分离、筛选、鉴定中药中的有效成分为目标,发展了包含提取手段、分离鉴定、基于细胞模型的活性成分筛选、高通量中药化合物鉴定等新技术和新方法,为中药有效成分的分离分析提供了较为全面的研究方法。这些新方法和新技术的发展对于中药有效成分的分离分析十分重要,有利于中药的质量筛查及物质基础探索。这些针对中药有效成分分析的新方法和新技术的建立,有利于不断的在中药研究领域挖掘出更多的创新型解决方案。

【关键词】：
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R284
【目录】：

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【引证文献】

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本文编号：127072