共载盐霉素和氯喹的纳米脂质体体外抗肝癌细胞和肝癌干细胞的作用研究

发布时间：2017-05-04 07:02

  本文关键词：共载盐霉素和氯喹的纳米脂质体体外抗肝癌细胞和肝癌干细胞的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：我国是肝癌发病率较高的国家,目前对其尚缺乏有效的治疗手段,因此,迫切需要寻找一种有效的治疗方案。而肝癌干细胞(LCSCs)被认为是肝癌复发、转移和耐药的主要原因,因此消除LCSCs对于肝癌的治疗至关重要。最近研究发现,盐霉素(SAL)对多种肿瘤干细胞(CSCs)具有杀伤作用,而且在体内和体外均能够抑制肝癌细胞增殖并诱导其凋亡。因此,本课题首先选用SAL作为杀伤LCSCs的化疗药物。然而,研究表明肿瘤中的非CSCs可以自发和随机地变成CSCs,这就严重降低了只靶向CSCs治疗策略的治疗效果。因此,对于癌症的治疗,需要同时消除CSCs和非CSCs才能达到良好的治疗效果。最近,联合治疗被认为是治疗肿瘤的有效方法。目前,已经有大量报道证明自噬抑制剂与化疗药物联用可以有效治疗肿瘤。因此,本课题将SAL与自噬抑制剂氯喹(CQ)联用,在SAL杀伤LCSCs的同时,通过CQ抑制自噬的作用增强SAL杀伤肝癌细胞的作用。另外,将SAL与CQ联用还可以降低SAL的用量,从而减少其毒副作用。然而,两种药物联用可以产生三种作用,即协同作用,相加作用和拮抗作用。因此,我们需要对其进行优化,得到两者联用的最佳协同比例。但由于不同的药物具有不同的药代动力学特性,因此游离药物可能无法维持协同比例到达肿瘤部位,这就需要通过药物递送系统来实现。而研究表明,共递送系统比单独的药物递送系统表现出更好的治疗效果。更重要的是,有证据表明,对于癌症的治疗,共递送两种药物会产生协同作用,而两个单独递药系统的简单物理混合物则不会有这种效果。因此,我们将SAL和CQ以协同比例共包载于同一纳米脂质体中,不仅增强了抗肿瘤的效果,而且进一步降低了SAL的毒性。本文的第一部分首先采用悬浮球培养方法从HepG2细胞中分离出具有干细胞特性的微球体,简称为HepG2-TS。然后,分别考察了SAL和CQ对HepG2细胞和HepG2-TS的杀伤作用,并得到了各自的IC50值。其中SAL对HepG2细胞的IC50=5.200±0.719μM,对HepG2-TS的IC50=0.321±0.079μM;CQ对HepG2细胞的IC50=10.531±1.322μM,对HepG2-TS的IC50=18.687±3.018μM。说明SAL对HepG2-TS具有更强的杀伤作用。最后,考察了两者联用时在不同浓度和不同比例的条件下,对HepG2细胞和HepG2-TS的杀伤作用,从而确定了两者联用的最佳协同比例,即SAL:CQ=1:5(mol/mol)。第二部分建立了SAL和CQ的体外含量测定方法并对其进行了方法学考察。结果显示,SAL在10~1280μg/m L的浓度范围内,与峰面积呈良好的线性关系,线性回归方程为A=1028C-661.1(R2=1)。CQ在5~320μg/mL的浓度范围内,与峰面积呈良好的线性关系,线性回归方程为A=38435C-46890(R2=0.9999)。且所建立的SAL和CQ的体外含量测定方法具有特异性,精密度和准确度均符合要求,因此,本课题接下来的实验均采用该方法作为药物含量的测定方法。第三部分以氢化大豆卵磷脂(HSPC)、胆固醇和DSPE-PEG2000为材料,摩尔比为85:10:5,采用乙醇注入法和硫酸铵梯度法分别制备了空白纳米脂质体(NL)、载SAL的纳米脂质体(SNL)、载CQ的纳米脂质体(CNL)和共包载SAL和CQ的纳米脂质体(SCNL)。所得纳米脂质体的粒径为120 nm左右,分散均匀,形态圆整,zeta电位为-13.7~-17.1 mV。SNL中SAL的包封率(EE)约为70%,载药量(DL)约为3%;CNL中CQ的EE约为70%,DL约为10%;SCNL中SAL和CQ的EE和DL与SNL和CNL基本一致,且二者的摩尔比约为1:5。第四部分对药物和纳米脂质体在体外抗HepG2细胞和HepG2-TS的活性进行了研究。分别采用CCK-8法考察细胞毒性,Annexin V-FITC/PI双染法考察细胞凋亡的情况,以及克隆形成实验考察HepG2细胞的增殖能力。结果表明,SAL和CQ以协同比例联用可以显著提高对HepG2细胞的杀伤作用,诱导凋亡的能力和抑制增殖的能力,而对于HepG2-TS则没有明显的增强作用。另外,SNL和CNL联用组及SCNL组在HepG2细胞中都表现出最强的杀伤作用,诱导凋亡的能力和抑制增殖的能力,而在HepG2-TS中虽然不像在Hep G2细胞中那样具有明显的增强作用,但也同样具有较强的杀伤作用和诱导细胞凋亡的能力,且这两者之间抗HepG2细胞和HepG2-TS的作用没有统计学差异。第五部分我们首先采用Western-Blot考察了HepG2细胞和HepG2-TS的基本自噬水平。结果发现,HepG2细胞的基本自噬水平比HepG2-TS高。接着,我们又考察了不同处理组(即SAL、CQ、SAL+CQ、NL、SNL、CNL、SNL+CNL和SCNL)对HepG2细胞和HepG2-TS基本自噬水平的影响,发现在HepG2细胞中,各处理组都具有较强的诱导基本自噬水平下降的作用,而在HepG2-TS中则没有这种作用。这就解释了第四部分的结果,即由于HepG2细胞的基本自噬水平高,而自噬对于肿瘤细胞是一种保护作用,因此,当SAL与自噬抑制剂CQ联用后,可以通过抑制HepG2细胞的自噬水平增强对其抗肿瘤活性,而HepG2-TS由于基本自噬水平较低,所以抑制自噬并不能增强对其抗肿瘤活性。综上所述,SCNL在体外具有较强的抗肝癌细胞和LCSCs的作用。另外,初步证明了CQ可以通过抑制自噬增强SAL对HepG2细胞的抗肿瘤活性。
【关键词】：肝癌 盐霉素 氯喹 协同作用 纳米脂质体 自噬
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943;R96
【目录】：

• 摘要9-11
• Abstract11-14
• 缩略词表14-15
• 前言15-18
• 第一章 SAL和CQ的细胞毒性实验18-30
• 一、仪器与试剂18-19
• （一） 仪器18
• （二） 试剂18-19
• （三） 细胞19
• 二、实验方法19-24
• （一） 肝癌细胞的培养19-20
• （二） 肝癌干细胞的培养20-21
• （三） 细胞毒性21-23
• （四） 联合效应23-24
• 三、结果与讨论24-28
• （一） HepG2细胞和HepG2-TS的生长状态24-25
• （二） 细胞毒性25-26
• （三） 联合效应26-28
• 四、小结28-30
• 第二章 SAL和CQ含量测定方法的建立30-39
• 一、仪器与试剂31-32
• （一） 仪器31
• （二） 试剂31-32
• 二、实验方法32-33
• （一） SAL体外HPLC定量分析方法的建立32-33
• （二） CQ体外HPLC定量分析方法的建立33
• 三、结果与讨论33-38
• （一） SAL体外HPLC定量分析方法的建立33-36
• （二） CQ体外HPLC定量分析方法的建立36-38
• 四、小结38-39
• 第三章 纳米脂质体的制备及表征39-46
• 一、仪器与试剂39-40
• （一） 仪器39-40
• （二） 试剂40
• 二、实验方法40-42
• （一） 空白纳米脂质体（NL）的制备40-41
• （二） 载SAL的纳米脂质体（SNL）的制备41
• （三） 载CQ的纳米脂质体（CNL）的制备41
• （四） 共包载SAL和CQ的纳米脂质体（SCNL）的制备41
• （五） 纳米脂质体的表征41-42
• 三、结果与讨论42-45
• （一） 纳米脂质体的粒径和zeta电位42-43
• （二） 纳米脂质体的形态43-44
• （三） 载药量（DL）、包封率（EE）44-45
• 四、小结45-46
• 第四章 体外抗肝癌细胞和肝癌干细胞的活性研究46-62
• 一、仪器与试剂46-49
• （一） 仪器46-47
• （二） 试剂47-48
• （三） 细胞48-49
• 二、实验方法49-54
• （一） 细胞毒性49-51
• （二） 细胞凋亡51-53
• （三） 克隆形成实验53-54
• 三、结果与讨论54-60
• （一） 细胞毒性54-56
• （二） 细胞凋亡56-59
• （三） 克隆形成实验59-60
• 四、小结60-62
• 第五章 SAL和CQ抗肝癌细胞和肝癌干细胞的机制研究62-74
• 一、仪器与试剂62-65
• （一） 仪器62
• （二） 试剂62-64
• （三） 细胞64-65
• 二、实验方法65-70
• （一） HepG2细胞和HepG2-TS的基本自噬水平65-68
• （二） 联合用药对HepG2细胞和HepG2-TS自噬水平的影响68-70
• 三、结果与讨论70-72
• （一） HepG2细胞和HepG2-TS的基本自噬水平70-71
• （二） 联合用药对HepG2细胞和HepG2-TS自噬水平的影响71-72
• 四、小结72-74
• 参考文献74-80
• 盐霉素：一种新型抗癌药物（综述）80-88
• 参考文献85-88
• 硕士期间发表论文及参加科研工作情况88-89
• 致谢89

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Caitlin A Schonewolf;Monal Mehta;Devora Schiff;Hao Wu;Bruce G Haffty;Vassiliki Karantza;Salma K Jabbour;;Autophagy inhibition by chloroquine sensitizes HT-29 colorectal cancer cells to concurrent chemoradiation[J];World Journal of Gastrointestinal Oncology;2014年03期

  本文关键词：共载盐霉素和氯喹的纳米脂质体体外抗肝癌细胞和肝癌干细胞的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：344578