温度和pH双敏感纳米凝胶的制备及其抗乳腺癌协同机制研究

发布时间：2017-05-19 12:14

  本文关键词：温度和pH双敏感纳米凝胶的制备及其抗乳腺癌协同机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：5-氟尿嘧啶(5-FU)是一种尿嘧啶类似物,通过抑制脱氧胸苷酸合成酶以及插入RNA和DNA而干扰核苷代谢,对细胞产生毒性,引起细胞死亡,被广泛应用于乳腺癌的治疗。然而,其强烈毒副作用的出现,极大限制了5-FU的临床疗效。因此,亟待探索治疗新策略。纳米医药的兴起有望解决传统化疗存在的问题。作为广泛应用的纳米材料之一,纳米凝胶是一种能够被水溶胀的、具有三维铰链网络结构的纳米级高分子聚集体,其多孔的网络结构,不但能显著增强凝胶体系的体内外稳定性,且能负载大量亲水性生物活性药物,成为递送亲水性化疗药物5-FU的最佳载体。此外,通过引进功能性单体获得具有刺激响应性的凝胶,即智能纳米凝胶。其中,聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)已被大量用于构建温度响应性纳米载药体系,其体积相转变温度(VPTT)约为32℃,基于PNIPAM的凝胶能够随着温度的变化发生微观结构和性能的转变。然而,对于该温敏凝胶药物递送系统在细胞水平的机制研究很少。我们知道,阳离子聚乙烯亚胺(PEI)因其可逆质子化链,不仅能够有效穿过双层磷脂膜结构,还具有pH响应性,适用于研究纳米体系在细胞水平的机制。因此,本课题中,我们利用自由基接枝共聚合反应并通过在线(in-situ)自组装制备了具有温敏PNIPAM内核和pH敏感PEI外壳的双敏感智能纳米凝胶[Poly(N-isopropyl acrylamide-g-ethylene amine),PNIPAM-g-PEI]。动静态光散射仪、Zeta电位仪和透射电镜的辅助数据进一步确认该纳米凝胶具有规整的核壳结构和可被精细调节的表面物化特性,随着PEI链的增加,该纳米凝胶的VPTT从32℃提高到了39℃。体内外研究表明,该智能纳米凝胶是负载水溶性药物5-FU(5-FU-gel)的有效载体,因其温敏被动靶向功能而特异高效地富集在肿瘤部位,使胞内药物浓度增高,对乳腺癌的疗效显著、持久。我们以乳腺癌细胞系MDA-MB-231为靶细胞,深入探索载药纳米凝胶诱导肿瘤细胞死亡的方式及其胞内水平相关机制。CCK-8检测的增殖抑制结果表明,5-FU-gel能显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖;且随着孵育温度从37℃(TVPTT)升高到40℃(TVPTT),细胞对纳米凝胶体系的内吞量明显增加,证实基于PNIPAM的温敏被动靶向功能。研究表明,纳米体系的胞内路径主要是内涵体-自噬体-溶酶体,我们在激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)下通过荧光共定位和自噬相关蛋白LC-3的检测来追踪凝胶体系的胞内路径,并利用3-甲基腺嘌呤(3-MA)和氯喹(CQ)来调节相关细胞器的形成。结果显示,纳米凝胶主要富集于溶酶体,联合3-MA抑制自噬的起始步骤后主要富集于内涵体,而联合CQ抑制自噬下游步骤后主要富集于自噬体。另一方面,CCK-8检测结果显示5-FU-gel、5-FU-gel+CQ、5-FU-gel+3MA对乳腺癌细胞的杀伤能力依次降低,提示溶酶体是载药纳米凝胶发挥作用的主要细胞器。我们进一步研究了可质子化的PEI是否会引起溶酶体依赖的相关机制。通过检测溶酶体结合膜蛋白LAMP-2及组织蛋白酶B,发现5-FU-gel的PEI链在溶酶体中酸性pH环境下发生质子化,利用质子海绵效应使纳米凝胶溶胀,大量释放所负载的5-FU,抑制靶细胞核苷酸的生物合成,从而杀伤靶细胞;同时,强质子化后的PEI链能破坏溶酶体膜,使组织蛋白酶B弥散至胞质中,引起下游信号通路的激活。经FITC-Annexin V和PI双染后,用流式细胞术检测意外地发现,5-FU-gel能够诱导MDA-MB-231细胞凋亡,且孵育温度为40℃时的凋亡程度比37℃时更加明显。通过CLSM观察线粒体膜电位变化和细胞色素c释放情况,并用western blot技术检测caspase-9蛋白表达水平,进一步发现5-FU-gel引起线粒体膜电位下降、细胞色素c释放和caspase-9蛋白表达量增加,说明5-FU-gel诱导的细胞凋亡是线粒体介导的caspase依赖性的凋亡。综上所述,温度和pH双敏感纳米凝胶可通过温敏内核促进其被肿瘤细胞摄取,具有被动靶向功能;同时,我们率先研究发现,其质子化的PEI外壳不但能大量释放所负载的亲水性化疗药物5-FU,且能通过破坏溶酶体和线粒体膜从而协同诱导caspase依赖性细胞凋亡。本课题展示了负载5-FU智能纳米凝胶引起肿瘤细胞死亡的协同机制研究上的巨大进步及其在临床应用中的潜在价值,期望能为更好地设计靶向细胞器的纳米药物提供理论基础。
【关键词】：5-氟尿嘧啶 纳米凝胶 温敏 质子化 凋亡
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943;R96
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 缩略词表10-12
• 前言12-14
• 第一部分 智能纳米凝胶的制备及性能研究14-23
• 一、实验材料15
• 二、实验方法15-17
• 三、实验结果17-21
• 四、实验结果分析与讨论21-23
• 第二部分 智能纳米凝胶的抗乳腺癌作用研究23-33
• 一、实验材料24
• 二、实验方法24-28
• 三、实验结果28-31
• 四、实验结果分析与讨论31-33
• 第三部分 智能纳米凝胶的抗乳腺癌协同机制研究33-55
• 一、实验材料34-38
• 二、实验方法38-43
• 三、实验结果43-48
• 四、实验结果分析与讨论48-55
• 全文总结55-56
• 参考文献56-59
• 综述 纳米凝胶的特性和生物医学应用59-70
• 参考文献66-70
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明70-71
• 致谢71

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本文编号：378670