聚精氨酸修饰的酸敏感脂质体的构建和评价

发布时间：2017-05-21 08:10

  本文关键词：聚精氨酸修饰的酸敏感脂质体的构建和评价，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:肿瘤靶向制剂已成为近几年治疗癌症的研究热点,此种制剂可以将药物尽可能多的输送到靶组织,进而发挥药物的治疗作用。脂质体具有类似生物膜的结构,作为纳米给药制剂的一种非病毒载体,因其具有低的免疫原性、低毒性以及靶向性等优点,已广泛作为肿瘤靶向制剂的重要载体。但是,脂质体仍然存在体内易被网状内皮系统清除、稳定性差、摄取效率低等问题,因此,设计一种修饰后的改良脂质体对生物大分子有效输送到靶器官具有重要意义。本研究构建了三种具有不同功能性脂材的PEG化脂质体:普通载药脂质体NL、CPP修饰载药脂质体CL和含腙键CPP修饰载药脂质体CHL。并对三种脂质体进行电位和粒径的表征,以MCF-7和A549细胞为模型细胞,对不同脂质体与细胞作用特点进行考察。方法:1琥珀酰亚胺基-对甲酰基苯甲酸甲酯(SFB)和3-马来酰亚胺基丙酸酰肼(MPH)分别制备储备液,充氮气,室温搅拌,旋蒸挥去有机溶剂,得干燥的黄色固体S-M。2自制的S-M与DSPE-PEG-NH2分别溶解,室温充氮气搅拌,得中间体DSPE-PEG-Hz。3取CPP样品管,室温平衡30min溶解,加入到DSPE-PEG-Hz溶液中,充氮气,室温避光反应48h,旋蒸挥干有机溶剂,得黄色目标产物DSPE-PEG-Hz-CPP。4构建普通载药脂质体NL、CPP修饰载药脂质体CL和含腙键CPP修饰载药脂质体CHL,并用马尔文粒度仪进行粒径和电位的表征。操作方法如下:分别以SPC/DC-chol/Chol/DSPE-PEG、SPC/DC-chol/Chol/DSPEPEG/DSPE-PEG-CPP、SPC/DC-chol/Chol/DSPE-PEG/DSPE-PEG-Hz-CPP为脂材旋转成膜,加DEPC水(含si RNA 3.75nmol),手摇水化脱膜,水浴超声,得半透明体系NL、CL、CHL。5用流式细胞术和激光共聚焦显微镜分析经NL、CL、CHL处理的MCF-7和A549细胞,流式分析以胞内平均荧光强度考察指标,评价细胞摄取效率。激光共聚焦显微镜清楚地显示了三种制剂输送si RNA至细胞中的位置。6用激光共聚焦显微镜分析经CL、CHL处理的A549细胞,观察si RNA是否从内涵体中逃逸,发挥基因沉默效应。结果:1合成S-M:黄色固体粉末,质谱图中m/z=413.36,与S-M理论计算值413.36(M+H+)相符,证明产物结构正确。2合成DSPE-PEG-Hz:中间体平均离子峰为3103.41,与理论设计肽平均分子量相符,证明产物中有目标中间体。3合成DSPE-PEG-Hz-CPP:产物平均分子离子峰为4611.08,与理论设计肽平均分子量相符,证明合成了目标产物。但是质谱图中可看到一个平均分子量为2832.19的杂峰,为第二步的原料DSPE-PEG-NH2,产物合成的方法以及纯化的步骤还需改进。4载药普通脂质体NL、CPP修饰载药脂质体CL和含腙键CPP修饰载药脂质体CHL粒径和电位测得结果如下:NL、CL、CHL的平均粒径分别为124.9nm、145.6nm、156.1nm,分散指数(PDI)平均值分别为0.302、0.246、0.284,制得的脂质体粒径均符合要求,且粒径分布集中,体系均趋于稳定。5用流式细胞仪和激光共聚焦分析经三组制剂处理的细胞相比阴性对照组,普通载药制剂NL处理的细胞胞内平均荧光强度有很大的提高,表明DSPE-PEG修饰的PEG化脂质体提高了细胞摄取效率。CPP修饰载药脂质体CL和含腙键CPP修饰载药脂质体CHL处理的细胞胞内平均荧光强度相比NL大幅提高,表明CPP修饰的载药PEG化脂质体能进一步增强细胞的摄取效率。激光共聚焦显微镜结果显示,三种制剂均成功地将si RNA输送到细胞质中,经CPP修饰的脂质体CL、CHL输送si RNA至细胞质中的数目(绿色荧光)相比普通脂质体NL明显增多,与流式分析结果相对应。6用激光共聚焦显微镜分析经CL、CHL制剂处理的A549细胞两组制剂均成功将si RNA输送到细胞质中,且随着制剂作用时间的延长,细胞质中si RNA的数目越多,表明经CPP修饰的脂质体有效地促进了si RNA的胞内逃逸。结论:实验结果表明,DSPE-PEG-Hz-CPP的合成路线简单,合成过程中未用高毒性试剂,方法重现性好。成功地制备了含腙键的CPP修饰的载药脂质体CHL,并与普通脂质体NL和CPP修饰载药脂质体CL进行细胞摄取效率的比较。三组制剂均使得细胞摄取效率提高,经CPP修饰的载药脂质体CL和CHL的细胞摄取效率相对较高。
【关键词】：细胞穿透肽 腙键 脂质体 siRNA RNA干扰
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943
【目录】：

• 摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 英文缩写12-13
• 引言13-15
• 第一部分 功能性脂材DSPE-PEG-Hz-CPP的合成15-21
• 前言15
• 材料与方法15-17
• 结果17-18
• 附图18-20
• 讨论20
• 小结20
• 参考文献20-21
• 第二部分 脂质体的制备和表征21-29
• 前言21
• 材料与方法21-23
• 结果23-24
• 附图24-26
• 附表26-27
• 讨论27
• 小结27-28
• 参考文献28-29
• 第三部分 脂质体-细胞相互作用29-42
• 前言29
• 材料与方法29-34
• 结果34-35
• 附图35-39
• 附表39-41
• 讨论41
• 小结41
• 参考文献41-42
• 结论42-43
• 综述pH和离子敏感的聚合物在药物释放过程中的应用43-56
• 参考文献52-56
• 致谢56-57
• 个人简历57

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