尺寸可控的顺铂载药胶束的制备、表征及抗肿瘤活性研究

发布时间：2017-05-22 12:09

  本文关键词：尺寸可控的顺铂载药胶束的制备、表征及抗肿瘤活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：顺铂(CDDP)是肿瘤临床治疗的一线药物,但它的肝脏和肾脏毒性限制了其在临床应用。纳米药物载体为CDDP在治疗肿瘤中的应用提供了新思路,可通过主动或者被动靶向提高CDDP在肿瘤组织中滞留,降低毒副作用。但是,纳米药物也存在一些缺陷,如：较差的稳定性、没有持久的药物释放能力、较低的载药率等；此外,纳米药物的尺寸效应与肿瘤治疗效果之间的关系也研究甚少。因此,一种更有效的尺寸可控的CDDP纳米载药系统亟待发展。本课题基于γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的纳米胶束是一种新型可降解的纳米材料,γ-PGA分子两侧有大量亲水性羧基基团,通过脱水缩合反应将具有疏水基团的苯丙氨酸(Phe)接入γ-PGA侧链,在水相中所形成的纳米胶束由内部的疏水基团(苯环)和外部的亲水基团(羧基)组成。通过调节γ-PGA分子量,利用纳米胶束疏水基团形成的内部空腔和纳米胶束表面装载或络合药物CDDP,制备和表征了两种纳米尺寸的纳米药物M(Pt):M(Pt)-1和M(Pt)-2。进一步比较了两种纳米尺寸药物M(Pt)在细胞水平和动物水平抑制肿瘤的效果。主要研究内容和结果如下：1.M(Pt)的制备,表征和性质研究本文通过高温酸解法(PH=3.0,98℃)调节γ-PGA分子量,成功制备出了尺寸可控的γ-PGA纳米胶束。我们制备出了两种有明显尺寸差别的γ-PGA纳米胶束(106.3±11nm和221.3±18nm),它们所对应的γ-PGA的分子量分别是100KD与50KD。两种尺寸的纳米药物M(Pt)-1和M(Pt)-2对CDDP的装载率均比一般的CDDP药物载体的载药率要高出20%左右；M(Pt)-1与M(Pt)-2均有较好的稳定性,在室温条件下可稳定存在一周；在10%新鲜血清的生理盐水中,纳米药物M(Pt)在连续7天的累计释放CDDP的量达到70%左右,表明M(Pt)具有较好的缓释能力。2.M(Pt)的体外生物学活性本文比较了较小尺寸(100nm)纳米药物M(Pt)-1,与较大尺寸(200nm)纳米药物M(Pt)-2对三种肿瘤细胞：HeLa, B16F10和A549的杀伤效率。纳米药物M(Pt)对三株细胞的致死能力为HeLaB16F10A549。M(Pt)-1对三株细胞在48h的IC50依次为：4.97±0.8μg/ml,6.94±0.89μg/ml,14.53±1.09μg/ml; M(Pt)-2对三株细胞在48h的IC50依次为：10.63±2.2μg/ml,11.20±1.12μg/ml, 19.99±1.42μg/ml。FITC荧光标记的M(Pt)-1,M(Pt)-2与HeLa细胞分别孵育15min、 30min、60min,荧光显微镜下的观察结果如下：(1)M(Pt)-1组与M(Pt)-2组细胞表面的荧光强度均具有时间依赖性,孵育时间越久细胞表面荧光强度越高；(2)M(Pt)-1组细胞较M(Pt)-2组细胞荧光强度高；(3)M(Pt)-2组与M(Pt)-1组细胞相比,荧光多数聚集在细胞表面。以上研究结果表明,纳米药物M(Pt)仍保留了对肿瘤细胞的致死能力,100nm左右的小尺寸M(Pt)-1能更快的被细胞摄取。3.M(Pt)的体内生物学活性以4mg/kg的M(Pt)-1,M(Pt)-2药物剂量,连续7天尾静脉注射健康KM鼠,以空载y-PGA纳米胶束为对照,观察纳米药物M(Pt)在小鼠体内的累积毒性。在注射的第5天,实验组小鼠的体重开始明显下降,表明100nm的M(Pt)-1和200nm的M(Pt)-2在体内的累积会造成一定的累积毒性；25天的统计结果显示两种尺寸药物M(Pt)处理组之间无明显差异,同时小鼠的体重得到了恢复。我们进一步比较了M(Pt)-1与M(Pt)-2体内的抗肿瘤能力,在抑制B16-F10黑色素瘤肺转移中,M(Pt)-1组小鼠肺组织的转移灶少于M(Pt)-2实验组。在抑制HeLa肿瘤增殖的实验中,M(Pt)-1组肿瘤体积小于M(Pt)-2组小鼠肿瘤体积,且两组肿瘤体积有显著性差异(P0.05),20天后的M(Pt)-1组和M(Pt)-2组肿瘤体积变化的平均值分别为207.42和347.18。以上结果表明,M(Pt)-1较M(Pt)-2有更好的肿瘤治疗效果。CDDP,M(Pt)-1与M(Pt)-2在血液循环周期中的检测结果如下：(1)CDDP很快被血液循环清除,10h后血液中Pt含量仅为500ng Pt/mL;(2)相比而言,纳米药物M(Pt)血液循环周期更长,10h后血液中的含量约为3000ng Pt/mL。组织分布结果显示,10h后M(Pt)-1组小鼠在肿瘤组织中的Pt含量也较M(Pt)-2组小鼠高,平均滞留量(n=3)分别为20.55和8.28ng/mg tissue。M(Pt)-1组中肝脏,肾脏,脾脏,心脏和肺中Pt的含量与肿瘤组织中的含量的比值分别为：1.07,0.60,0.64,0.55,0.67；在M(Pt)-2组中肝脏,肾脏,脾脏,心脏和肺中Pt的含量与肿瘤组织中的含量的比值分别为：2.11,1.54,1.43,0.48,0.78。以上M(Pt)-1与M(Pt)-2的对比结果表明,在小鼠体内10Onm的M(Pt)-1有更好的肿瘤组织滞留效果；在小鼠体内的相对毒性数值表明M(Pt)-1有更低的肝肾毒性损伤。综上所述,本研究所制备的纳米药物M(Pt),具有尺寸可控,稳定性好,缓释能力强,对CDDP的载药量高等优势,有较好临床应用前景；本研究结果表明100nm的M(Pt)-比200nm的M(Pt)-1有更好的肿瘤治疗效果,M(Pt)-1在肿瘤组织中比M(Pt)-2有更高的滞留量,本文将为开发治疗肿瘤疾病的纳米药物提供新思路。
【关键词】：γ-聚谷氨酸纳米胶束 顺铂 抗肿瘤效果 尺寸效应 组织分布
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943;R96
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-15
• 第一章 绪论15-26
• 1. 引言15-17
• 2. 纳米药物载体的研究进展17-22
• 2.1 无机纳米颗粒及有机纳米颗粒17-18
• 2.2 多功能纳米颗粒的研究18-21
• 2.3 对纳米颗粒结构的研究21-22
• 3. 聚谷氨酸偶联抗肿瘤药物CDDP的研究22-24
• 4. 本论文研究的目的和意义24-26
• 第二章 纳米药物M(Pt)的合成与表征26-49
• 1. 引言26-27
• 2. 实验仪器与试剂27-29
• 2.1 实验仪器27
• 2.2 实验试剂27-28
• 2.3 溶液配制28-29
• 3. 实验方法29-32
• 3.1 基于γ-PGA纳米胶束的制备及鉴定29-31
• 3.1.1 不同分子量γ-PGA的制备29
• 3.1.2 γ-PGA纳米胶束的制备29-30
• 3.1.3 γ-PGA-PAE纳米材料的核磁鉴定30
• 3.1.4 DLS法检测γ-PGA纳米胶束的纳米尺寸30
• 3.1.5 TEM分析γ-PGA纳米胶束的形态表征30
• 3.1.6 Nanosight检测γ-PGA纳米胶束浓度及粒径30-31
• 3.2 M(Pt)的合成及表征31-32
• 3.2.1 M(Pt)的制备31
• 3.2.2 检测M(Pt)的装载率31
• 3.2.3 M(Pt)的UV-Vis光谱扫描31-32
• 3.2.4 M(Pt)的稳定性32
• 3.2.5 M(Pt)的体外释放32
• 4. 实验结果32-46
• 4.1 不同分子量的γ-PGA的制备32-33
• 4.2 L-PAE不同接入率的TEM表征33-35
• 4.3 DLS法对M(Pt)尺寸的表征35-37
• 4.4 TEM对纳米药物M(Pt)形态的分析37
• 4.5 利用NanoSight分析M(Pt)37-40
• 4.6 γ-PGA-PAE的核磁表征40-41
• 4.7 M(Pt)装载CDDP的检测41-42
• 4.8 对M(Pt)稳定性的探究42-43
• 4.9 M(Pt)的体外释放43-45
• 4.10 M(Pt)的UV-Vis的光谱扫描45-46
• 5. 讨论46-49
• 第三章 纳米药物M(Pt)的体外生物学活性49-62
• 1. 引言49
• 2. 实验材料与试剂49-51
• 2.1 实验细胞49
• 2.2 实验仪器及耗材49-50
• 2.3 实验试剂50
• 2.4 缓冲液及培养基的配置50-51
• 3. 实验方法51-54
• 3.1 细胞的培养51-53
• 3.1.1 细胞传代51-52
• 3.1.2 细胞复苏与冻存52-53
• 3.2 检测γ-PGA纳米胶束的安全性53
• 3.3 对M(Pt)的细胞毒性检测53-54
• 3.4 HeLa细胞对M(Pt)摄取能力的检测54
• 4. 结果分析54-60
• 4.1 M(Pt)对肿瘤细胞的抑制54-56
• 4.2 HeLa细胞对M(Pt)的摄取能力分析56-60
• 5. 讨论60-62
• 第四章 纳米药物M(Pt)的体内生物学活性62-89
• 1. 引言62
• 2. 实验相关材料62-64
• 2.1 实验所用细胞62
• 2.2 实验动物及饲养条件62-63
• 2.3 主要实验仪器及耗材63
• 2.4 实验试剂63-64
• 2.4.1 分子生物学试剂63
• 2.4.2 细胞培养基63-64
• 3. 实验方法64-71
• 3.1 M(Pt)的急性毒性实验64-65
• 3.2 建立小鼠黑色素瘤肺转移模型65
• 3.3 建立HeLa肿瘤裸鼠模型65-66
• 3.4 血清生化指标分析66
• 3.5 组织切片及HE染色66-69
• 3.6 M(Pt)的血液循环周期69-70
• 3.7 M(Pt)的组织分布70-71
• 4. 结果分析71-86
• 4.1 M(Pt)的体内急性毒性分析71-74
• 4.2 血清指标的检测结果74-76
• 4.3 M(Pt)抑制黑色素瘤肺转移分析76-79
• 4.4 M(Pt)抑制肿瘤生长的活性分析79-83
• 4.5 裸鼠肝脏、脾脏、肾脏的HE染色分析83-84
• 4.6 M(Pt)在体内的代谢及组织分布的分析84-86
• 5. 讨论86-89
• 第五章 全文总结89-92
• 附录92-93
• 参考文献93-98
• 致谢98

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  本文关键词：尺寸可控的顺铂载药胶束的制备、表征及抗肿瘤活性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：385675