苛求芽孢杆菌尿酸酶保守序列突变对其性质的影响

发布时间：2017-05-22 14:32

  本文关键词：苛求芽孢杆菌尿酸酶保守序列突变对其性质的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：苛求芽孢杆菌(ATCC29604)胞内尿酸酶含322个残基,四聚体为活性形式。此尿酸酶在pH 7.4和37℃时半衰期约为23天,比真菌尿酸酶热稳定性高近10倍。分析晶体结构发现,此尿酸酶N端前9位残基和C端296到302位残基以反向β-折叠方式聚拢成二聚体并维持亚基界面上的活性中心,其中N端有碱性和酸性的残基而C端主要是酸性的残基。本项目基于尿酸酶构象分析、序列比对和定点突变,探索保守序列在酶热稳定性和活性中的作用,为其分子改造奠定基础。1.苛求芽孢杆菌尿酸酶N端序列对其性质的影响野生型N端序列为AERTMFYGKGDV;据其晶体结构,分析附近静电作用网络设计改变其静电网络的N端突变体。比较发现N端残基突变后Ki、Km、最适温度和最适pH变化较小,但比活性和热稳定性变化不同。野生型尿酸酶比活达约11.5kU/g,前三个氨基酸的突变ARR、QQR、RQR、VQR的比活分别为6.3kU/g、7.0kU/g、8.6kU/g、 9.3kU/g,非变性PAGE电泳发现均为四聚体,RER突变体比活提高到13.5kU/g。这些突变体在37℃时热稳定性与野生酶基本一致,4℃pH9.2时稳定性略有下降。但突变体RESRESRER、REGREGRER、 SSSSSRER比活性下降到4.3kU/g、2.7kU/g、4.8kU/g,经非变性PAGE电泳发现仍为四聚体,且热稳定性在37℃pH 7.4变化显著,分别为1.3d,0.75d,16d。最特别的是突变体Y7F,其比活能保留27%,但在37℃中性条件热失活加速1000倍。2.苛求芽孢杆菌尿酸酶C端序列对其性质的影响对C端305位以后残基突变或者截断或延长C端考察性质改变。突变体D307R、去307都没有活性,突变体去314、R310E、R311R、 E318R、Y319F、L322R分别为3.2kU/g.4.4kU/g、3.6kU/g、3.3kU/g、 2.9kU/g、3.6kU/g,均为四聚体；中性条件下37℃热稳定性明显下降但碱性条件稳定性变化小。突变体L322SNSNSN、L322DSNSNSN、 L322DSNSNSNHHHHHH表达之后经DEAE-纤维素、制备型电泳纯化后最高比活保留66%,且热稳定性基本不变。无论C端还是N端加入His标签后比活性都会下降,但热稳定性影响不大,用Ni2+-NTA纯化效果与DEAE-纤维素接近,但效率高很多。3.苛求芽孢杆菌尿酸酶中间保守区突变对其性质的影响。序列比对发现在此尿酸酶中间也有保守序列。其中A68L、T69V、 D70L、K73E、F179L、D185N、S243A、I244F、Q245I、H246E均无活性,非变性PAGE电泳观察表达产物主要为二聚体；F179L为四聚体却仍无活性。突变体D70N、S71A、T188V、T189V、E192Q、Y249F、 F298L、Q299I、F301L的活性分别为0.55kU/g、0.34kU/g、 0.65kU/g、 0.53kU/g、1.85kU/g、4.71kU/g、1.97kU/、0.93kU/g、2.59kU/g;突变体D70N为二聚体,但有活性。在37℃和4℃及pH 7.4和pH 9.2时,这些突变体热稳定性均显著下降,其中D70N、T188V、E192Q热失活半衰期只为原来的0.1%。4.苛求芽孢杆菌尿酸酶亚基之间离子键改变对其性质的影响在此尿酸酶四聚体晶体结构中,每个二聚体中每个亚基的R140、 E142、E291、R293与另一个二聚体中对应相邻亚基的E142、R140、R293和E291形成四对离子键；据此两个二聚体间形成八对离子键。突变体R140E、R140Q、E142R、E291Q、E291R中,E142为四聚体无活性,其余活性为1.3kU/g、1.6kU/g、13.3kU/g、0.1kU/g; E291Q活性较高但稳定性最差。突变体N141C、P292C能形成二硫键,但不能提高稳定性。这7个突变体与氧嗪酸钾结合,在相应条件下的热稳定性都可以显著提高,最强的增强效应达到数百倍。5.苛求芽孢杆菌尿酸酶序列和性质关系此尿酸酶及其突变体解聚失活后,抑制剂氧嗪酸和黄嘌呤及底物尿酸可诱导聚合再组装成活性四聚体。此尿酸酶C端有独特构象且C端参与形成的静电网络、保守序列间氢键都是活性和稳定性所必须；四聚体内部相邻亚基之间的离子键也是维持活性四聚体的关键。在低温下,此尿酸酶初期非常稳定,但构象变化积累到一定程度后活性快速指数衰减,呈现明显的两阶段失活过程。总体而言,此尿酸酶有优异热稳定性,可能是此尿酸酶长期进化效应积累所致。
【关键词】：苛求芽孢杆菌尿酸酶 保守序列定点突变 热稳定性 组氨酸标签
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R915
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-14
• 前言14-18
• 参考文献16-18
• 第一部分 苛求芽孢杆菌尿酸酶N端序列对其性质的影响18-31
• 1 材料与方法18-21
• 2 实验方法21-25
• 3 结果25-30
• 4 本部分小结30-31
• 第二部分 苛求芽孢杆菌尿酸酶C端序列对其性质的影响31-37
• 1 材料与方法31
• 2 实验方法31-32
• 3 结果32-35
• 4 本部分小结35-37
• 第三部分 苛求芽孢杆菌尿酸酶中间保守区突变对其性质的影响37-45
• 1 材料与方法37
• 2 实验方法37-38
• 3 结果38-44
• 4 本部分小结44-45
• 第四部分 苛求芽孢杆菌尿酸酶离子键对其性质的影响45-52
• 1 材料与方法45
• 2 实验方法45
• 3 结果45-51
• 4 本部分小结51-52
• 全文总结52-53
• 致谢53-54
• 攻读硕士学位期间发表的论文54

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本文编号：386013