Myrothecine A通过miR-221调控肝癌细胞增殖及树突状细胞成熟机制的研究

发布时间：2017-07-07 12:16

  本文关键词：Myrothecine A通过miR-221调控肝癌细胞增殖及树突状细胞成熟机制的研究

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【摘要】：Myrothecine A是从黄花蒿内生真菌Myrothecium roridum IFB-E012发酵产物中分离得到的、具有细胞毒性的10,13环单端孢霉烯型大环内酯类化合物。已有文献报道了该化合物的绝对构型,并初步探讨了其在内共生和生物催化方面的潜在意义。本论文旨在探讨myrothecine A体外抗肿瘤的初步机制以及它在免疫调节方面的作用。最新研究发现,miR-221是肿瘤发生发展过程中的重要调节者,它能与其靶基因的3’UTR区结合,在转录后水平对基因进行调控,起着癌基因的作用,广泛参与肿瘤细胞增殖、分化和凋亡等过程。树突状细胞(Dendritic cells, DC)是目前发现的体内抗原递呈功能最强大的细胞,是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。近年来发现,miRNAs能广泛参与DC发育、分化、成熟等过程。因此,本论文从以下两个方面探讨myrothecine A对miR-221的调节作用以及对肝癌细胞增殖和DC成熟的影响：一、研究myrothecine A通过miR-221对肝癌细胞增殖的作用及机制；二、观察myrothecine A通过miR-221对DC成熟的影响,以期为myrothecine A成为新的抗肿瘤以及免疫调节药物提供实验依据。首先,我们研究myrothecine A通过miR-221对肝癌细胞增殖的影响及机制。我们用不同浓度的myrothecine A处理人肝癌细胞株SMMC-7721, MTT法检测肝癌细胞的活性。结果发现,当myrothecine A浓度达到1 μg/mL时,能明显抑制肝癌细胞的增殖,并且随着浓度的增加,myrothecine A对肝癌细胞的抑制作用呈现出剂景依赖性。接下来,我们使用不同浓度的myrothecine A分别处理人肝癌细胞株SMMC-7721后,采用流式细胞术测定细胞周期,结果显示,myrothecine A能将细胞阻滞在S期。为了进一步探讨myrothecine A诱导肝癌细胞S期阻滞及抑制细胞增殖的机制,我们建立了miR-221过表达细胞模型,然后观察myrothecine A是否可通过miR-221抑制肝癌细胞的增殖。结果显示,转染miR-221过表达慢病毒质粒后,SMMC-7721细胞中miR-221的表达明显增高,相比于对照组,miR-221能明显促进肝癌细胞增殖。然后,加入1 μg/mL myrothecine A后,这种促进作用能明显被抑制,表明myrothecine A能逆转miR-221引起的肝癌细胞增殖。为进一步探讨其机制,我们用1μg/mL myrothecine A处理miR-221过表达的肝癌细胞株SMMC-7721,24h后,通过实时荧光定量PCR检测miR-221的表达水平,并用Western blot检测miR-221的靶基因p27kipl(下文记作p27)的表达。结果显示,myrothecine A能显著抑制miR-221的表达。在肝癌细胞中转染miR-221过表达慢病毒质粒后,p27的表达水平明显下降。但加入1 μg/mL myrothecine A后,p27的表达水平可明显增加。以上结果说明,myrothecine A能通过抑制miR-221的表达而影响p27的表达水平,进而调控肝癌细胞的增殖。其次,我们观察myrothecine A通过miR-221对DC成熟的影响。在DC成熟过程中,抗原递呈能力逐渐增强,并高水平表达表面共刺激分子,如CD86、CD40、CD80等,因此,我们首先将未成熟的小鼠DC与miR-221过表达稳转细胞株Hepal-6(小鼠肝癌细胞株)共培养,用流式细胞术检测DC表面CD86和CD40分子的表达水平。结果显示,miR-221过表达能显著抑制DC表面CD86和CD40的表达,表明miR-221可抑制DC的成熟。接下来,我们在未成熟的小鼠DC与miR-221过表达稳转细胞株Hepal-6共培养的基础上,又加入1 μg/mL myrothecine A,作用24h后,进行流式细胞术检测。结果发现,加入myrothecine A后,DC表面CD86和CD40分子的表达都有不同程度的增加,提示myrothecineA能逆转miR-221对DC成熟的抑制作用。这些结果表明,myrothecine A能通过miR-221调控肝癌微环境中DC的成熟。而细胞因子如Arg-1、TGF-β、iNOS、IL-10、IP-10等可抑制免疫细胞的分化、成熟及功能,为探明miR-221抑制DC成熟的机制,我们将miR-221过表达慢病毒质粒感染Hepal-6后,收集细胞,提取mRNA,实时荧光定量PCR检测这些细胞因子的表达。结果发现,只有IP-10的表达明显增加,提示miR-221可能通过增加IP-10的表达抑制DC的成熟。综上所述,myrothecine A一方面可以通过抑制miR-221的表达,增加p27的蛋白水平,进而抑制肝癌细胞的增殖。另一方面,myrothecine A也可以通过miR-221增加DC表面CD86和CD40分子的表达,从而促进肝癌微环境中DC的成熟发挥抗肿瘤作用。
【关键词】：Myrothecine A miR-221 肝癌细胞 增殖 DC 成熟
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-8
• 符号说明8-9
• 前言9-11
• 第一部分 Myrothecine A通过miR-221调控肝癌细胞增殖11-28
• 1 材料11-14
• 2 方法14-18
• 3 结果18-26
• 4 讨论26-28
• 第二部分 Myrothecine A通过miR-221调控肝癌细胞微环境中DC的成熟28-46
• 1 材料28-29
• 2 方法29-32
• 3 结果32-44
• 4 讨论44-46
• 结论46-47
• 参考文献47-51
• 文献综述51-60
• 参考文献56-60
• 硕士期间发表论文60-61
• 致谢61-62

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本文编号：530164