新型HIV非核苷逆转录酶抑制剂和辅助受体抑制剂体外抗病毒活性研究

发布时间：2017-07-17 21:40

  本文关键词：新型HIV非核苷逆转录酶抑制剂和辅助受体抑制剂体外抗病毒活性研究

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【摘要】：研究背景人类免疫缺陷病毒(HIV)是目前国际研究中已知变异较快的病毒。我国在大规模开展高效抗逆转录病毒治疗(HAART)下,耐药性的产生导致抗病毒治疗失败。因而有必要研发新型药物,设计可以抑制耐药病毒的药物。目前抗HIV药物分为核苷类逆转录酶抑制剂,非核苷类逆转录酶抑制剂,蛋白水解酶抑制剂、融合抑制剂、辅助受体抑制剂和整合酶抑制剂等。大部分的新型药物是基于这些药物的设计对原有化合物进行不断的改进。由于HIV的高度变异性,不同靶点、不同的设计的药物对不同亚型的HIV抑制活性的敏感性是不同的,对于耐药病毒株的抑制能力也各不相同。体外抑制活性的检测是新型抑制剂对HIV抑制作用最直观的评价指标,利用我国HIV主要流行株对药物抑制活性检测可以鉴定抑制活性的广普性,为药物后续开发和研究提供重要的参考依据。研究目的1.通过对HIV-1SF33、HIV-1BAL和HIV-1A17实验室标准株体外抑制活性的检测对新型HIV抑制剂进行初步评价和筛选,研究新型HIV抑制剂对我国HIV主要流行株的体外抑制活性；2.通过体外药物压力实验探讨新型HIV抑制剂耐药机制。研究方法研究对象：本研究的非核苷逆转录酶抑制剂是由北京大学医学部药学院设计合成的11种尿嘧啶类化合物编号为W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、 W23及W24；和12种吡啶酮类化合物编号为W12、W13、W14、W15、W16、W25、W26、W27、W40、W41、W42及W43。辅助受体抑制剂是由复旦大学基础医学院提供的2种CCR5辅助受体抑制剂XLLN-148-40和XLLN-148-42。分别选用实验室标准病毒株和我国临床分离HIV病毒在体外筛选这些抑制剂的抗病毒活性。实验方法：1.HIV流行株的制备：全血用于检测CD4+T细胞计数,从全血中分离出的血浆用于病毒载量和病毒亚型的检测。剩余PBMCs附集层使用梯度离心法得到PBMCs,与健康人的PBMCs共同培养得到病毒培养上清。病毒培养上清经过再次感染健康人的PBMCs后培养、收集并进行P24抗原检测及滴度测定,用于药物抗HIV体外抑制活性的检测。2.HIV抑制剂体外活性评价：将HIV抑制剂连续梯度稀释后分别与TZM-B1、 PBMC和MT4三种细胞作用,通过活细胞染色检测OD值计算出抑制剂的半数细胞致死浓度(CC50)。同样将HIV抑制剂连续梯度稀释后分别在TZM-B1、 PBMC和MT4三种细胞系上抑制等量且定量的HIV病毒,通过检测细胞发光值或P24抗原含量连同对应的药物浓度计算出该抑制剂的半数抑制浓度(EC50)。计算CC50/EC50从而得到药物的选择指数sI。3.HIV-1体外诱导耐药：使用药物抑制病毒在MT4细胞上的复制,连续培养14周时间并不断增加药物使用剂量,对最终得到的培养上清进行基因测序,得到发生突变的耐药位点。4.感染性克隆病毒的制备：使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit对质粒进行定点诱变。主要通过PCR法引入点突变,对之前得到的耐药位点在感染性克隆上进行点突变后进行抑制剂抑制活性检测,用于验证耐药突变的产生。研究结果1.11种尿嘧啶化合物对HIV-1SF33毒株的体外抑制活性EC50为0.002uM-2.071uM,选择指数S150在39-38215之间；12种吡啶酮化合物对HIV-1SF33毒株的体外抑制活性EC50为0.003uM-0.103uM,选择指数S150在386-28760之间。经过HIV-1A17耐药标准株的筛选,尿嘧啶化合物W6、W8、W9、W24及吡啶酮化合物W12、W25、W26、W42对其具有抑制活性,体外抑制活性EC50分别为0.091uM-2.543uM和0.090uM-2.755uM。选择指数S1分别在48-1080之间和73-1068之间。其中化合物W6对HIV-1SF33毒株的体外抑制活性EC50达到了0.002uM。2.尿嘧啶化合物W6对我国HIV主要流行的CRF07 BC亚型抑制活性EC50为0.003uM-0.006uM,对B’亚型抑制活性EC50为0.001uM-0.004uM,对CRF01 AE亚型抑制活性EC50为0.001uM-0.006uM,选择指数S150分别在12735-40933、18021-76410和22967-76410之间。3.使用化合物W6抑制HIV-1SF33在MT4上的复制。连续培养14周并不断增加化合物使用剂量,最终的培养上清经过基因测序和比对得到耐药突变位点Y188L和V106I。4.通过构建分别含有耐药突变位点Y188L和V106I克隆病毒后在次进行体外抑制活性检测,确认了具有Y188L和V106I突变位点的感染性克隆使化合物W6的抑制活性下降。5.CCR5辅助受体抑制剂XLLN-148-40、XLLN-148-42对HIV-1SF33双嗜性实验室标准株和HIV-1BALCCR5单嗜性标准株及HIV-1A17非核苷类逆转录酶耐药的标准株抑制活性EC50分别为0.871uM、14.959um、8.641um、0.006uM、0.059uM和0.078uM,选择指数S150分别为66.8、1148.1、115.7、16949.2、16666.7和35714.3。XLLN-148-40对我国HIV主要流行的CRF07_BC亚型抑制活性EC50为0.898uM-12.246uM,对B’亚型抑制活性EC50为2.368uM-47.052uM,对CRF01_AE亚型抑制活性EC50为0.362uM-163.137uM,抑选择指数S150在6.1-5181.3之间,XLLN-148-42对我国HIV主要流行的CRF07_BC亚型抑制活性EC50为0.003uM-0.527uM,对B’亚型抑制活性EC50为0.0002uM-0.602uM,对CRF01_AE亚型抑制活性EC50为0.031uM-0.793uM,选择指数S150在1661-5000000之间。研究结论本研究中的尿嘧啶化合物、吡啶酮化合物以及CCR5辅助受体抑制剂对HIV-1SF33双嗜性实验室标准株均有不同程度的抑制活性。化合物W6在尿嘧啶化合物组中抑制活性最强；W42是吡啶酮化合物组中同时对实验室标准株和耐药标准株同时具有极强抑制活性的化合物。化合物W6对我国HIV主要流行株具有广泛的抑制作用,但在长期使用后仍会出现以Y188L和V1061突变为主的耐药。CCR5辅助受体抑制剂XLLN-148-40、XLLN-148-42对HIV-1SF33双嗜性实验室标准株、HIV-1BALCCR5单嗜性标准株和HIV-1A17耐药标准株以及我国HIV主要流行株均具有不同程度的抑制作用,化合物XLLN-148-42的抑制活性明显高于化合物XLLN-148-40。
【关键词】：HIV非核苷逆转录酶抑制剂 辅助受体抑制剂 HIV临床分离株 体外抑制
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要5-9
• Abstract9-14
• 英文缩略词表14-15
• 前言15-22
• 材料和方法22-41
• 结果41-55
• 讨论55-61
• 总结61-62
• 参考文献62-67
• 个人基本情况67-68
• 硕士期间文章发表情况68-69
• 致谢69-70
• 发表文章70-76

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本文编号：554711