人与鼠源内皮抑素基因合成和原核表达及功能验证

发布时间：2017-05-21 21:13

  本文关键词：人与鼠源内皮抑素基因合成和原核表达及功能验证，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：血管内皮抑素最初是从小鼠血管内皮瘤细胞株的培养基中分离纯化而来,一种内源性血管生成抑制剂,是胶原蛋白18C末端的一个片段,能特异性地抑制新生血管内皮细胞的增殖从而抑制血管的增生,内皮抑素不影响已生成成熟血管的功能,因此是一种理想的新生血管生成抑制剂,在临床上用于抑制肿瘤血管生成从而达到肿瘤治疗目的,重组内皮抑素主要通过大肠杆菌原核表达系统获得,其中绝大部分是以包涵体形式存在。人与鼠源内皮抑素基因具有高度的同源性和相似的生物学功能。本文将确定人与鼠源内皮抑素基因并构建不同表达标签的原核表达载体探讨内皮抑素的可溶性表达以及验证重组人源内皮抑素对新生血管的抑制作用。方法：根据文献报道和NCBI数据库确定Human Endostatin ( IE)和Mouse Endostatin (ME) DNA序列,DNA合成法分别获得人与鼠源内皮抑素基因,加入不同酶切位点设计引物,进行PCR扩增后胶回收,分别与携带谷胱甘肽巯基转移酶(GST)表达标签的原核表达质粒pGEX-4T1和携带硫氧还蛋白A(TrxA)表达标签的原核表达质粒pET-32a进行双酶切处理、T4DNA连接酶连接,构建原核表达质粒pGEX-4T1-HE 和 pET-32a-ME,将两种质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达,确定人与鼠源内皮抑素的诱导表达条件,将诱导后的菌液超声破碎,离心后上清和沉淀分别进行蛋白电泳确定蛋白分布,将内皮抑素包涵体洗涤、变性、复性、浓缩后获得重组蛋白,最后通过鸡胚绒毛尿囊膜实验验证人源重组内皮抑素蛋白的抗血管生成活性。结果：测序分析表明成功合成人与鼠源内皮抑素基因,通过PCR扩增确定人与鼠源内皮抑素基因大小为560bp左右,与理论符合,通过分子克隆分别将人与鼠源内皮抑素基因连接进入原核表达质粒pGEX-4T1和pET-32a,经PCR、双酶切、测序分析显示原核表达载体pGEX-4T1-HE和 pET-32a-ME构建成功,在37℃,1mmol/LIPTG浓度下,大肠杆菌BL21(DE3)中人、鼠源内皮抑素成功表达,通过SDS-PAGE分析,与空白组相比,实验组出现目的条带,其中人源内皮抑素重组蛋白在46 kDa处出现,鼠源内皮抑素重组蛋白在39 kDa处出现,与理论相符,人与鼠源内皮抑素主要以包涵体形式表达,在破碎后的菌体上清中没有发现内皮抑素的分布,通过对包涵体的洗涤、纯化、复性获得人与鼠源重组内皮抑素蛋白,在鸡胚绒毛尿囊膜实验中,与对照组相比,实验组的血管数少,血管管径细。结论：研究结果表明获得了长度为554 bp的人源内皮抑素基因和长度为565 bp的鼠源内皮抑素基因,成功构建了人与鼠源内皮抑制素基因不同标签表达载体,在大肠杆菌中成功诱导表达。成功获得人与鼠源ES重组蛋白；CAM实验结果也证明了纯化复性后的人源重组蛋白能明显抑制新生血管的生长。我们的研究结果也表明TrxA标签和GST标签对增进重组ES可溶表达没有显著差异,两组标签的重组蛋白都主要存在于包涵体内。
【关键词】：内皮抑素 基因合成 重组蛋白 纯化 蛋白标签 鸡胚绒毛尿囊膜试验
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914.5;R96
【目录】：

• 个人简历3-5
• 英文缩略语表5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-14
• 第一节 人、鼠源内皮抑素原核表达载体构建14-36
• 1.实验材料14-16
• 2.实验方法16-28
• 3.结果28-34
• 4 讨论34-35
• 5 结论35-36
• 第二节 人、鼠源内皮抑制素不同标签重组蛋白的表达纯化及活性分析36-47
• 1.实验材料36-39
• 2.实验方法39-40
• 3.结果40-44
• 4 讨论44-46
• 5 结论46-47
• 课题综述47-59
• 参考文献59-69
• 致谢69-70
• 攻读学位期间发表的学术论文目录70
• 感谢以下基金对本课题资助70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 肖创清;何云南;;血管内皮抑素的临床应用进展[J];放射免疫学杂志;2013年05期

2 季现秀;范理宏;;内皮抑素的生物活性及作用机制的研究进展[J];临床肺科杂志;2010年01期

3 秦叔逵;刘秀峰;王琳;陈映霞;钱军;华海清;龚新雷;杨柳青;何泽明;;重组人血管内皮抑素与化疗联合治疗肺外晚期恶性肿瘤的临床研究[J];临床肿瘤学杂志;2007年10期

4 李祥魁;范翠英;崔亚君;刘璇;;重组蛋白可溶性表达促进标签的研究进展[J];生物技术;2013年02期

5 ;新型重组人血管内皮抑素恩度治疗恶性浆膜腔积液的研究进展(英文)[J];Chinese-German Journal of Clinical Oncology;2011年08期

  本文关键词：人与鼠源内皮抑素基因合成和原核表达及功能验证，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：384852