NOX2调控的Complexin Ⅱ在缺血性中风后谷氨酸兴奋性神经毒性中的作用及机制

发布时间：2017-06-17 14:03

  本文关键词：NOX2调控的Complexin Ⅱ在缺血性中风后谷氨酸兴奋性神经毒性中的作用及机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景和目的：谷氨酸是中枢神经系统中含量最高的兴奋性氨基酸,尽管缺血性脑损伤的病理生理机制至今尚未完全明确,有足够的证据证明谷氨酸介导的兴奋性神经毒性参与了这一损伤过程。作为一种神经递质,生理情况下谷氨酸通过SNARE复合体介导的方式由突触前膜释放至突触间隙,SNAREs (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor-attachment protein receptor,可溶性N-己基顺丁烯二酰亚胺敏感因子结合蛋白)是由突触囊泡膜蛋白(vesicle-associated membrane protein, VAMP)、突触膜蛋白(soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein-25, SNAP25)口突触融合蛋白-1(Syntaxin-1)组成的多元复合体。现已明确,突触以钙依赖性胞裂外排方式释放神经递质依赖于SNARE复合体的装配过程,而这种装配过程又受其结合蛋白的影响,其中Complexinsl的作用非常重要。但在Complexins调控下SNARE复合体介导的神经递质释放过程是否在缺血性脑损伤中发挥作用,目前国内外文献尚未见报道。由于目前尚未发现针对Complexins的特异性阻断剂,我们通过研究Complexins及其介导的兴奋性神经毒性机制与引起脑缺血再灌注损伤的其他病理生理机制之间的关系来寻找干预Complexins通路的有效治疗措施。众所周知,自由基介导的氧化应激途径也是脑缺血再灌注损伤的重要病理生理机制,另有证据表明,在创伤性脑损伤模型中,抗氧化剂会逆转Complexins的表达变化,据此我们推测在脑缺血再灌注损伤中,Comlexins-SNARE复合体介导的兴奋性氨基酸谷氨酸释放的机制有可能受氧化应激机制调控。方法：采用大脑中动脉阻塞法建立局灶性脑缺血及再灌注损伤模型,并通过细胞糖氧剥夺法建立脑皮层神经细胞缺血及再灌注损伤模型,体内外分别应用基因敲低和RNA干扰等方法来研究SNARE复合体调控蛋白Complexins在缺血性脑损伤中的作用。通过行为学、形态学、分子生物学、高效液相荧光、免疫组织化学等方法,观察脑缺血及再灌注损伤后Complexins的表达变化,并明确其对脑缺血再灌注损伤后SNARE复合体及谷氨酸兴奋性神经毒性的影响。为了寻求对Complexins在缺血性脑损伤后作用的有效干预途径,我们通过使用NOX2基因敲除动物以及体外RNA干扰等方法研究了缺血性脑损伤后Complexins介导的兴奋性神经毒性机制受NADPH氧化酶NOX2催化亚基介导的氧化应激反应的调控。结果：与假手术对照组相比,缺血脑组织皮层半暗带中Complexin Ⅰ和Complexin Ⅱ的表达均显著升高。由于Complexin Ⅱ主要定位于兴奋性神经突触,对于兴奋性氨基酸谷氨酸的释放具有更为重要的作用,本研究继而使用携有靶向Complexin-Ⅱ shRNA的慢病毒进行体内外基因敲低,进一步明确了Complexin Ⅱ在缺血性脑损伤及SNARE复合体的装配和谷氨酸兴奋性神经毒性中的作用。体外实验的结果也验证了这一过程。进一步利用NOX2基因敲除动物以及体外RNA干扰等方法,我们发现NOX2基因缺失可以明显减轻脑缺血再灌注损伤,并可以逆转谷氨酸兴奋性神经毒性及Complexin Ⅱ的表达。结论：本课题首次揭示了Complexins在缺血性脑损伤后谷氨酸介导的兴奋性神经毒性机制中的作用和分子生物学机制,有望为充实、完善缺血性脑损伤的病理生理学机制提供新的内容,并首次证明了该作用受NADPH氧化酶NOX2介导的氧化应激通路所调控,从而为临床防治缺血性脑血管病提供新的靶点和思路,具有重要的理论意义和实际应用价值。
【关键词】：Complexins SNARE复合体 谷氨酸 脑缺血再灌注损伤 NADPH氧化酶
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 符号说明11-13
• 前言13-17
• 实验材料17-24
• 一、实验动物17
• 二、实验药品和试剂17-19
• 三、药品及试剂的配制方法19-22
• 四、基本仪器设备22-24
• 实验方法24-36
• 一、脑缺血再灌注损伤模型的制备24-26
• 二、实验步骤和观察指标26-34
• 三、统计学处理34-36
• 实验结果36-39
• 讨论39-43
• 结论43-44
• 附录44-65
• 参考文献65-68
• 致谢68-69
• 攻读硕士学位期间发表论文69-70
• 学位论文评阅及答辩情况表70

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本文编号：458482