米团花萜类合酶初步催化机制及三株微生物的代谢物研究

发布时间：2020-03-19 23:07

【摘要】：本论文共四章,第一章论述了米团花(Leucosceptrum canum)二萜/二倍半萜合酶初步催化机制的研究;第二章阐述了“六合一”(LHY)工程大肠杆菌代谢物及抗细菌活性的研究;第三章阐述了竹黄菌(Shiraia bambusicola)和竹红菌(Hpocrellabambusae)化学成分和生物活性的比较研究;第四章综述了竹红菌的化学成分、生物活性以及竹红菌素的给药研究进展。第一章米团花萜类合酶初步催化机制研究二倍半萜(sesterterpenoids)是五个异戊二烯结构单元构成分子骨架的一类天然产物,由二倍半萜合酶催化香叶基法尼基焦磷酸酯(geranylfarnesyl diphosphate,GFPP)衍生而来。前期实验室从米团花腺毛中克隆并功能鉴定了一个双功能二萜/二倍半萜合酶,但它的活性中心以及如何调控两种萜类产物合成的机制尚未知晓。在此基础上,本论文通过对LcTPS25进行定点突变,成功构建了 11个突变酶,并对突变酶进行了体内酶活实分析,结果发现7个突变酶(LcTPS25-277Y/W,-277Y/A,-415I/S,-429W/G,-447T/A,-505N/A和-509V/F)的二倍半萜和二萜合酶活性均显著降低,其中突变酶LcTPS25-277Y/w完全失去活性;突变酶LcTPS25-411L/A的活性变化小,LcTPS25-516F/A的二倍半萜合酶活性显著增强,而LcTPS25-419M/G和-512R/A的二倍半萜合酶活性有一定的增强。另外,本论文研究了LcTPS25在植物体内的功能。构建了LcTPS25和GFPPS瞬时表达载体,并通过农杆菌介导的转化方法实现目的基因在烟草中的瞬时表达。结果显示LcTPS25在烟草瞬时表达体系的酶活产物与其在大肠杆菌表达体系的产物一致,表明LcTPS25的功能可能不受表达宿主的影响。本论文揭示了LcTPS25的初步催化机制,为深入研究植物二倍半萜合酶的催化机制奠定了基础,同时也为二倍半萜化合物的生物合成及代谢工程改造提供了科学依据。第二章“六合一”工程大肠杆菌代谢物与抗细菌活性研究线虫(nematode)是一类病原微生物,植物寄生线虫对全球农作物造成重大危害。课题组前期发现,细菌型聚酮合酶-非核糖体肽合酶(PKS-NRPS)杂合生源次级代谢产物thermolides有显著毒杀线虫活性,并构建了 1株高温菌PKS-NRPS基因簇、谷胱甘肽硫-转移酶、细胞色素P450酶、转运蛋白、水解酶和烯酰还原酶在大肠杆菌BL21中共表达的菌株“六合一”(Lhy)。本论文利用多种柱层析对该工程大肠杆菌发酵液的乙酸乙酯萃取浸膏进行了化学成分的分离与纯化,从中分离鉴定了 15个化合物,包括7个氯霉素的酰基取代衍生物(glhy9～glhy15)。测试glhy10～glhy15的抗细菌活性,发现其活性均比氯霉素低,表明细菌可以通过酰基化作用将氯霉素变成毒性较低的氯霉素衍生物,为细菌抵抗氯霉素的作用机制研究奠定了基础。第三章竹黄菌和竹红菌化学成分及细胞毒活性的比较研究竹黄菌和竹红菌是我国民间用于治疗胃病和风湿性关节炎的传统中药,但它们的区别少有报道。为研究二者的差异,本论文对两种真菌子座的甲醇提取物进行了跟踪分离,从竹黄菌和竹红菌中分别分离鉴定了 14个和8个化合物,两者相同的成分为竹红菌甲素(gSb1)、竹红菌乙素(gSb2)、竹红菌丙素(gSb3)、过氧麦角甾醇(gHb6)、3,6,8-三羟基-1-甲基口山酮(gHb7)和3,8-二羟基-6-甲氧基-1-甲基口山酮(gHb8),其中gSb1～gSb3是两种真菌主要的相同成分;二者主要差异成分为11,11'-二去氧沃替西林(gSb4)和灰黄霉素(gHb5)。首次从竹黄菌中分离到麦角甾-7,22E-二烯-3β,5α,6β-三醇(gSb8)和麦角甾-7,22E-二烯-2β,3α,9α-三醇(gSb10),并首次从竹红菌中分离到竹红菌丁素(gHb4)、gHb5、gHb7和gHb8。活性筛选发现,gSb4对人肺腺癌细胞、人肝癌细胞和人乳腺癌细胞有很强细胞毒活性,gSb1活性较强,而gHb4活性微弱,表明竹黄菌可能比竹红菌更具有抗肿瘤应用前景,为二者的开发利用提供了参考价值。第四章竹红菌的研究进展本章综述了截止2019年3月国内外报道的竹红菌的化学成分、生物活性和竹红菌素的给要研究。
【图文】：

图１．２筛选的氨基酸残基的位点和结构逡逑Ｆｉｇ邋１．２邋Ｓｉｔｅ邋ａｎｄ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｓｃｒｅｅｎｅｄ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｒｅｓｉｄｕｅｓ逡逑

图１．３Ｂ）突逡逑变酶对酶活产物的影响较小，揭示了邋４１１位亮氨酸突变成Ｒ基更小的丙氨酸后对逡逑ＬｃＴＰＳ２５活性的影响较其它突变酶小
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284

【参考文献】

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本文编号：2590853