rHSA-ONC促进大鼠肝癌细胞RH-35凋亡的研究
本文关键词：rHSA-ONC促进大鼠肝癌细胞RH-35凋亡的研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：豹蛙抗瘤酶(Onconase,ranpirnase,ONC)是一种天然的蛋白质,提取于北极豹蛙的卵母细胞和早期胚胎中,它有很强的杀伤力,在体内外的许多肿瘤试验中都得到了很好的体现,是第一个进入抗肿瘤临床试验的核糖核酸酶。目前,临床试验中所用的ONC均取自蛙卵和早期胚胎,其存在制备工艺复杂和获取困难等问题,难以满足临床需要。本实验室利用人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)的高表达特性,根据ONC(AF332139.1)及HSA(NM_000477.5)的基因序列,通过密码子优化及GC含量调整等方法设计并优化rONC及其融合蛋白rHSA-ONC的基因序列,并在融合蛋白间插入不同长度的以Gly4Ser1为模板进行重复的连接肽,得到了高表达的融合蛋白,简称rHSA-M(0,1,2,3)-ONC。为了研究本实验室纯化的rONC和rHSA-M(0,1,2,3)-ONC对肝癌细胞的杀伤作用,本实验用不同浓度的rONC和rHSA-M(0,1,2,3)-ONC处理体外培养的大鼠肝癌细胞RH-35,通过磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)比色法检测不同处理组RH-35细胞的增殖率;Hoechst染色法检测不同处理组RH-35细胞的活性;流式细胞术检测细胞周期时相的分布和凋亡率;qRT-PCR和Western Blot法检测细胞内BCL-2、BAX等基因和蛋白的表达变化;划痕法检测细胞迁移的情况。结果发现rONC和rHSA-M(0,1,2,3)-ONC作用于RH-35细胞后,细胞抑制率与药物处理时间和浓度呈正相关(P0.05),rONC组细胞抑制率最高,rHSA-M0-ONC组的细胞抑制率最低;rONC组使细胞处于G0/G1期的比例较rHSA-M(0,1,2,3)-ONC组多,rONC组细胞凋亡率较rHSA-M(0,1,2,3)-ONC组明显增加,rHSA-M0-ONC组的细胞凋亡率最低;rONC组和rHSA-M(0,1,2,3)-ONC组均能使BCL-2表达下调,BAX表达上调;rONC组抑制细胞迁移的能力较rHSA-M(0,1,2,3)-ONC组高。综上所述,rONC和rHSA-M(0,1,2,3)-ONC均能抑制RH-35细胞的增殖并且促进其凋亡,但对增殖的抑制作用和对凋亡的促进作用存在差异。其中rONC的活性最强,rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的活性与连接肽长度有关,随着连接肽长度增加,融合蛋白对RH-35细胞增殖的抑制作用逐渐增强;rONC和rHSA-M(0,1,2,3)-ONC可通过上调BAX表达和下调BCL-2表达,从而促进大鼠肝癌细胞RH-35凋亡,抑制增殖,其凋亡机制可能与BCL-2、BAX表达变化相关。
【关键词】：豹蛙抗瘤酶 融合蛋白 大鼠肝癌细胞RH-35 增殖抑制 细胞凋亡
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-3
【目录】：
- 摘要4-6
- ABSTRACT6-11
- 缩略词表11-13
- 1 文献综述13-33
- 1.1 核糖核酸酶概述13-14
- 1.2 几种常见的核糖核酸酶14-20
- 1.2.1 牛胰腺核糖核酸酶A(RNase A)14-15
- 1.2.2 牛蛙核糖核酸酶(RC-RNase)15
- 1.2.3 牛精核糖核酸酶(BS-RNase)15-16
- 1.2.4 血管生成素(Angiogenin,ANG)16-17
- 1.2.5 两栖酶( Amphinase)17-18
- 1.2.6 豹蛙抗瘤酶(P30，onconase，ONC)18-20
- 1.3 豹蛙抗瘤酶(ONC)的研究现状20-25
- 1.3.1 ONC的作用机理20-22
- 1.3.2 ONC与其它药物的协同作用、免疫调节和抗病毒作用22-23
- 1.3.3 ONC与细胞凋亡23
- 1.3.4 rONC的临床应用23-24
- 1.3.5 ONC的前景展望24-25
- 1.4 人血清白蛋白(HSA)的作用研究25-27
- 1.4.1 HSA的结构25
- 1.4.2 HSA的理化性质25-27
- 1.4.3 HSA的应用27
- 1.5 融合蛋白的特点及应用27-30
- 1.5.1 融合蛋白的概念27
- 1.5.2 融合蛋白的特点27-28
- 1.5.3 融合蛋白的应用28-30
- 1.6 研究目的、意义和内容30-33
- 1.6.1 研究目的30
- 1.6.2 研究意义30
- 1.6.3 研究内容30-33
- 2 材料与方法33-43
- 2.1 主要耗材及仪器33-34
- 2.2 主要试剂及配制34-37
- 2.3 rONC及其融合蛋白的获得37-38
- 2.3.1 rONC及其融合蛋白的构建与表达37-38
- 2.3.2 rONC及其融合蛋白的层析38
- 2.4 大鼠肝癌细胞RH-35 的培养38
- 2.5 细胞活性检测：磺酰罗丹明B比色法38-39
- 2.6 细胞生长状态观察: 普通光学显微镜39
- 2.7 细胞凋亡检测：Hoechst33258染色法39
- 2.8 细胞凋亡检测：AnnexinV-FITC/PI双标记法39-40
- 2.9 细胞周期检测：流式细胞术(Flow-Cytometry)40
- 2.10 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)40-41
- 2.11 SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳41
- 2.12 蛋白免疫印迹(Western Blot)41-42
- 2.13 细胞迁移能力检测：划痕实验法42
- 2.14 统计学分析42-43
- 3 结果43-51
- 3.1 rONC及rHSA-M_(0,1,2,3)-ONC对RH-35 细胞活性的影响43-44
- 3.2 rONC和rHSA-M_(0,1,2,3)-ONC对细胞生长状态的影响44-45
- 3.3 Hoechst33258染 色和Annexin V-FITC/PI双 染法流式检测rONC及rHSA-M_(0,1,2,3)-ONC对细胞凋亡的影响45-46
- 3.4 流式检测rONC及rHSA-M_(0,1,2,3)-ONC融合蛋白对细胞周期的影响46-47
- 3.5 rONC及rHSA-M_(0,1,2,3)-ONC融合蛋白对细胞增殖/凋亡相关基因和蛋白表达的影响47-48
- 3.6 rONC及其rHSA-M_(0,1,2,3)-ONC融合蛋白对RH-35 细胞迁移的影响48-51
- 4 讨论51-55
- 结论55-57
- 参考文献57-69
- 攻读硕士学位期间参加的科研项目和发表的论文69-71
- 致谢71-72
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