Aif-T18融合蛋白对TEM1阳性细胞的体外杀伤效果评价

发布时间：2017-06-02 19:01

  本文关键词：Aif-T18融合蛋白对TEM1阳性细胞的体外杀伤效果评价，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景与目的:恶性肿瘤的发病率近年来逐渐上升,严重威胁人体的生命和健康。虽然对癌症的治疗有手术,放化疗以及靶向治疗等方法,但都有其固有的局限性。因此,寻找新的稳定作用靶位,开发特异性杀伤肿瘤细胞的新型药物具有重要的临床意义。肿瘤内皮细胞标志分子1(TEM1)可在近乎所有实体瘤特别是卵巢癌相关细胞中大量表达,而在正常细胞中不表达或者表达水平很低。因此,TEM1可以作为肿瘤血管治疗的标志物。本实验室在前期研究中利用酵母抗体库筛选分离出了可同时结合人类和鼠类TEM1的高亲和力、特异性单链抗体(sc Fv T18)。本研究中,我们主要利用单链抗体sc Fv T18选择性携带凋亡诱导因子AIF,靶向抑杀TEM1阳性细胞,从而为Aif-T18融合蛋白在肿瘤治疗中的开发应用提供实验依据。方法:通过基因工程技术构建p IRES-TEM1-EGFP重组质粒,转染TEM1阴性细胞MS1并利用G418筛选出TEM1阳性细胞系(MS1-TEM1);构建p ET302-Aif和p ET302-Aif-T18(将sc Fv T18基因与AIF基因融合)重组质粒,转化到表达宿主菌BL21中,IPTG诱导得到所需的目的蛋白,之后利用流式细胞技术和MTT检测融合蛋白对MS1和MS1-TEM1细胞的亲和力以及杀伤效果。结果:成功构建了MS1-TEM1稳定细胞系,细胞流式结果显示:Aif-T18对MS1-TEM1细胞具有较强的结合能力,靶向性良好;MTT结果显示72 h后,Aif-T18对MS1-TEM1细胞具有很好的杀伤效果。结论:我们通过原核表达系统得到的Aif-T18融合蛋白对MS1-TEM1细胞具有明显的特异性杀伤效果,有望开发成为一种新型的抗肿瘤药物。
【关键词】：TEM1 实体瘤 单链抗体 AIF 肿瘤微环境
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-36
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第1章 前言10-16
• 1.1 肿瘤的治疗现状10-11
• 1.2 ADC药物治疗11-13
• 1.3 肿瘤内皮细胞标志分子 1（TEM1）研究现状13-14
• 1.4 凋亡诱导因子 (APOPTOSIS-INDUCING FACTOR，AIF)研究现状14-16
• 第2章 材料与方法16-35
• 2.1 实验材料16-17
• 2.1.1 试剂及试剂盒16-17
• 2.1.2 仪器设备17
• 2.1.3 实验所用细胞株和质粒17
• 2.2 实验所用溶液的配制17-19
• 2.3 实验方法19-35
• 2.3.1 TEM1的原核表达19-23
• 2.3.2 重组质粒p IRES-TEM1-EGFP的构建23-28
• 2.3.3 MS1-TEM1细胞系的构建28-29
• 2.3.4 p ET302-Aif-T18与p ET302-Aif重组质粒的构建29
• 2.3.5 p ET302-Aif-T18与p ET302-Aif蛋白的表达及纯化29-31
• 2.3.6 流式细胞技术检测重组蛋白对细胞的结合能力31-33
• 2.3.7 MTT技术检测重组蛋白对细胞的毒力33-35
• 第3章 结果与分析35-42
• 3.1 TEM1原核表达结果35-36
• 3.2 TEM1阳性细胞的构建及验证36-38
• 3.2.1 p CMV6-XL4与p GEM? -3Zf(-)双酶切结果36
• 3.2.2 p GEM-3ZF-TEM1与PIRES-EGFP双酶切结果36-37
• 3.2.3 MS1-TEM1荧光显微镜图37-38
• 3.2.4 p IRES-TEM1-EGFP转染MS1和MS1-TEM1细胞Western Blot验证38
• 3.3 Aif-T18融合蛋白与Aif蛋白的构建及验证38-42
• 3.3.1 p ET302-Aif-T18与p ET302-Aif重组质粒的构建38-39
• 3.3.2 Aif-T18融合蛋白与Aif蛋白表达、纯化及验证39-40
• 3.3.3 Aif-T18融合蛋白，Aif蛋白与细胞的结合能力40-41
• 3.3.4 Aif-T18融合蛋白，Aif蛋白对细胞的杀伤力41-42
• 第4章 讨论42-44
• 第5章 结论44-45
• 致谢45-46
• 参考文献46-49
• 攻读学位期间的研究成果49-50
• 综述50-57
• 参考文献55-57

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