人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞株的建立及其干细胞特性的研究

发布时间：2017-06-30 14:23

  本文关键词：人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞株的建立及其干细胞特性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景食管癌的全球发病率在恶性肿瘤中位居第8位,死亡率位居恶性肿瘤第6位。食管癌的最常见组织学类型是食管鳞状细胞癌。紫杉醇具有广泛的抗肿瘤活性,被广泛应用于治疗各种恶性肿瘤。然而,原发性或获得性耐药严重限制了紫杉醇的治疗潜力。紫杉醇的耐药机制目前尚不明确,进一步了解化疗过程中肿瘤细胞耐药的分子机制可能会发现新型治疗靶点并获得更佳化疗效果。多种肿瘤的肿瘤干细胞已被证明与肿瘤的发生、复发、转移和耐药密切相关。尽管一些研究证明了食管肿瘤干细胞的存在,但食管肿瘤干细胞的作用仍存在争论,且少有文献研究对紫杉醇耐药的食管鳞癌细胞是否具有肿瘤干细胞的特性。目的建立人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞株,探究人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞是否具有肿瘤干细胞的特性。研究对象人食管鳞癌细胞株EC109购自中科院上海细胞库第一部分人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞株的建立方法对人食管鳞癌细胞株EC109细胞进行复苏、传代和冻存,以紫杉醇为诱导药物,通过高剂量间歇诱导+时间递增的方式诱导出人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞株R-EC109。然后采用MTT法检测紫杉醇耐药细胞R-EC109的耐药稳定性。结果历时7m,诱导出人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞株R-EC109。MTT法检测耐药细胞株耐药稳定性,显示亲本细胞EC109半数抑制浓度(IC50)为0.068±0.003μg/m L,而耐药细胞R-EC109 IC50为3.578±0.089μg/m L(P0.001),两者差异具有统计学意义。耐药细胞R-EC109对紫杉醇耐药指数(RI)为67.258,属于高度耐药。在诱导结束30d、60d、90d、120d后再分别用MTT法检测耐药细胞R-EC109耐药稳定性,结果示其耐药指数维持在67左右,显示耐药细胞R-EC109的耐药稳定性良好。小结成功诱导出了高度耐药的、稳定性良好的人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞株R-EC109。第二部分人食管鳞癌细胞EC109和耐药细胞R-EC109的生物学对比鉴定方法取耐药细胞R-EC109和亲本细胞EC109分别进行培养,第三代以后用于实验。1.成球实验取对数生长期的耐药细胞R-EC109和亲本细胞EC109,以每孔5000个细胞接种于超低粘附6孔板中,每2d换半量的成球实验培养液。10d后,观察并计数耐药细胞R-EC109和亲本细胞EC109的成球情况。计数20个细胞的细胞球数目。2.克隆性细胞增殖实验以每瓶(细胞培养瓶面积25cm2)600个耐药细胞R-EC109或亲本细胞EC109的数量分别接种到细胞培养瓶中进行培养,每24h观察细胞生长情况,每2-3d更换培养液。10d后弃去培养液,100%甲醇固定细胞,0.5%结晶紫染色贴壁细胞,5min后弃去结晶紫及多余溶液。计数50个细胞的克隆个数。3.干性基因m RNA表达的鉴定取耐药细胞R-EC109和亲本细胞EC109分别加入裂解液,提取各自的总RNA,测定RNA浓度,鉴定RNA纯度,检测RNA完整性,然后进行干性基因m RNA反转录,最后进行定量PCR反应检测干性基因m RNA表达情况。4.侧群分选0.25%胰蛋白酶分别消化耐药细胞R-EC109和亲本细胞EC109,收集细胞,用RPMI1640(含HEPES)稀释细胞。将耐药细胞R-EC109和亲本细胞EC109各分为两组,实验组:加入维拉帕米液及Hoechst33342荧光染料;对照组:加入Hoechst33342荧光染料。用锡纸包裹,避光37℃水浴,孵育90min,然后收集细胞,用400目滤网过滤,立即用流式细胞仪分析各组中SP细胞含量。先进行散射光分析,去除细胞碎片,以形态良好的细胞群体为目标细胞。然后进行Hoechst33342双参数分析,以红光为X轴,以蓝光为Y轴。在已有图中设立活细胞门,用加入维拉帕米液的对照来确定侧群细胞位置。5.肿瘤浸润转移基因m RNA表达的鉴定分别提取耐药细胞R-EC109和亲本细胞EC109的总RNA,测定RNA浓度,鉴定RNA纯度,检测RNA完整性,然后进行m RNA反转录,最后通过定量PCR反应得出肿瘤浸润转移基因m RNA表达情况。结果1.耐药细胞R-EC109的成球率(13.2±2.1%)高于亲本细胞EC109的成球率(7.6±1.7%)(P0.01),具有较强自我更新能力。2.耐药细胞R-EC109的克隆形成能力(65.2±4.1%)高于亲本细胞EC109的克隆形成能力(36.8±3.9%)(P0.05)。3.耐药细胞R-EC109中干性基因Bmi-1(3.3544±0.4570)、Nanog(2.5657±0.2677)、Oct4(3.5767±0.3754)、Sox2(1.6788±0.1688)、ABCG2(2.8655±0.1700)、Nestin(3.1567±0.5879)和Ki-67(4.1678±0.5967)的表达高于亲本细胞EC109中干性基因Bmi-1(1±0.1468)、Nanog(1±0.0875)、Oct4(1±0.0976)、Sox2(1±0.1132)、ABCG2(1±0.0645)、Nestin(1±0.1670)和Ki-67(1±0.0746)的表达(P值均0.05)。4.耐药细胞R-EC109中SP侧群细胞含量(5.8%)高于亲本细胞EC109中SP侧群细胞含量(2.3%)(P0.05)。5.耐药细胞R-EC109中E-cadherin基因(0.6245±0.0598)的表达低于EC109细胞中E-cadherin基因(1±0.0479)的表达,而耐药细胞R-EC109中基因N-cadhe rin(2.5882±0.1330)、Snail(2.4767±0.0798)和Twist(2.8563±0.0797)的表达高于亲本细胞EC109中基因N-cadherin(1±0.0743)、Snail(1±0.0579)和Twi st(1±0.0780)的表达(P值均0.05),耐药细胞R-EC109的EMT过程更活跃。小结耐药细胞R-EC109具有肿瘤干细胞多重特性。其成球能力、克隆形成能力、干性基因m RNA的表达、SP侧群细胞含量均高于亲本细胞EC109,且其具有更强的转移侵袭能力,EMT过程更活跃。结论1.建立的人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞株R-EC109具有肿瘤干细胞多重特性。2.肿瘤干细胞可能是R-EC109细胞对紫杉醇耐药的根本原因之一。
【关键词】：食管鳞状细胞癌 肿瘤干细胞 肿瘤启动细胞 紫杉醇 耐药
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1
【目录】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-13
• 中英文缩略词对照表13-14
• 前言14-18
• 第一部分 人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞株的建立18-25
• 1 实验材料与方法18-22
• 2 实验结果22-23
• 3 讨论23-24
• 4 小结24-25
• 第二部分 人食管鳞癌细胞EC109 和耐药细胞R-EC109 的生物学对比鉴定25-42
• 1 实验材料与方法25-33
• 2 实验结果33-38
• 3 讨论38-41
• 4 小结41-42
• 结论42-43
• 参考文献43-49
• 综述 食管鳞癌干细胞及其耐药机制的研究进展49-61
• 参考文献56-61
• 个人简历、在校期间发表的学术论文61-62
• 致谢62-63

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本文编号：502283