膜联蛋白A2受体对人脉络膜黑色素瘤细胞凋亡及自噬作用的研究

发布时间：2017-07-06 05:07

  本文关键词：膜联蛋白A2受体对人脉络膜黑色素瘤细胞凋亡及自噬作用的研究

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【摘要】：目的：为探讨过表达膜联蛋白A2受体(human AnnexinⅡ receptor, AXⅡR)对人脉络膜黑色素瘤细胞凋亡以及自噬的作用。方法：首先构建表达质粒pcDNA3.1-AXⅡR,确证质粒表达后即可用于后续实验。应用脂质体法转染Mum-2B细胞,倒置显微镜观察过表达AXⅡR对Mum-2B细胞形态学的影响,采用CCK-8法检测细胞活力的变化,Hoechst 33258染色初步观察Mum-2B细胞凋亡水平的改变,Annexin-V/PI双染法流式细胞仪初步检测凋亡水平。通过Western Blotting法检测凋亡相关蛋白的含量及活化的水平以探讨凋亡发生的机制。为探讨过表达AXⅡR对Mum-2B细胞自噬过程的影响,应用Western Blotting检测自噬小体标志性蛋白LC3表达量及活性变化。包装lenti-GFP-LC3慢病毒后感染Mum-2B细胞,采用激光共聚焦显微镜观察GFP-LC3荧光融合蛋白证实自噬小体的存在。进一步地,我们进行了自噬流相关实验,包括检测p62蛋白及应用自噬阻断剂氯喹后对LC3表达量及活性变化的影响。最后,通过检测应用氯喹后细胞活力的变化及凋亡相关蛋白的改变以探讨自噬在过表达AXⅡR引起的Mum-2B细胞凋亡过程中的作用。结果：经基因测序显示表达质粒pcDNA3.1-AXIIR构建成功。人脉络膜黑色素瘤细胞选用Mum-2B细胞系。倒置显微镜观察发现过表达AXⅡR后Mum-2B细胞状态明显变差,CCK-8实验发现过表达AXⅡR组OD值明显小于空载体组和脂质体对照组,P0.050 Hoechst 33258染色实验可见过表达AXⅡR组细胞核呈现高亮致密蓝色荧光,Annexin-V/PI双染法流式细胞仪检测发现显示AXⅡR处理组细胞的凋亡百分率高于空载体组和脂质体对照组。Western Blotting免疫印迹实验显示凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8、Caspase-9、PARP均出现了切割片段,表明凋亡过程确被激活。过表达AXⅡR组中LC3-Ⅱ/LC3-I比值显著增加、p62蛋白表达下降,氯喹处理细胞后行发现LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换更为显著。此外,应用激光共聚焦显微镜观察GFP-LC3融合蛋白的荧光变化,结果发现转染pcDNA3.1-AXⅡR组出现点状聚集的绿色荧光,而空载体pcDNA3.1组和脂质体对照组呈现弥散的绿色荧光,以上均表明自噬过程被激活。最后,应用氯喹阻断自噬后发现Mum-2B细胞OD值明显小于溶剂对照处理组,caspase-3及PARP切割片段表达量显著上调,即阻断自噬后凋亡过程发生上调。结论：过表达AXⅡR引起Mum-2B细胞发生活力下降,这一过程与细胞凋亡有关,并且自噬在过表达AXⅡR引起Mum-2B细胞凋亡的过程中起着保护作用。
【关键词】：人脉络膜黑色素瘤 膜联蛋白A2受体 凋亡 自噬
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.7
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-7
• 缩略词表7-9
• 前言9-11
• 材料与方法11-27
• 一、材料与试剂11-16
• 二、方法16-27
• 结果27-37
• 一、成功构建融合表达质粒pcDNA3.1-AXⅡR27
• 二、过表达AXⅡR导致Mum-2B细胞活力发生下降27-29
• 三、过表达AXⅡR导致Mum-2B细胞发生凋亡29-31
• 四、过表达AXⅡR导致Mum-2B细胞发生自噬31-34
• 五、阻断自噬过程导致过表达AXⅡR的Mum-2B细胞活力下降34-35
• 六、自噬引发的保护作用与激活凋亡过程有关35-37
• 讨论37-42
• 小结42-43
• 综述43-47
• 参考文献47-56
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况56-57
• 致谢57

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本文编号：524805