丙戊酸致乳腺癌细胞放射增敏作用及其同源重组修复的分子机制研究

发布时间：2017-07-16 14:28

  本文关键词：丙戊酸致乳腺癌细胞放射增敏作用及其同源重组修复的分子机制研究

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【摘要】：目的乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤疾病之一,并严重威胁到女性的身心健康。由此,乳腺癌的治疗,特别是对乳腺癌的放射治疗问题一直备受全世界学者关注,如何增强乳腺癌细胞对放射的敏感性更是该领域学者们关注的焦点问题。丙戊酸(Valproic Acid, VPA)是一种含有8个碳原子的短链脂肪酸类的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors, HDACis),它通过抑制组蛋白去乙酰化酶的活性,进而导致细胞组蛋白高度乙酰化。临床上VPA主要用于癫痫患者的治疗,目前发现VPA不但对肿瘤细胞的生长具有抑制作用,还发现高浓度的VPA(如5mmol/L)可以增加乳腺癌细胞对放射的敏感性,提示VPA在乳腺癌放疗中可能是一个潜在的放射增敏剂,深入研究还揭示VPA放射增敏作用的一个可能机制是破坏了DNA损伤修复机制。但VPA在临床安全剂量范围内的放射增敏作用及其分子机制却不十分清楚。根据VPA治疗癫痫病的安全血药剂量为0.3-0.8mmol/L,本课题选择临床安全剂量0.5mmol/L和临界安全剂量1mmol/L的VPA,研究其对乳腺癌细胞MCF7放射敏感性的影响；同时,同源重组(Homologous Recombination, HR)是DNA双链断链修复的一个重要机制,本课题还探讨了VPA诱导的放射增敏作用中对HR修复的分子机制影响,目的在于为VPA用于临床上治疗乳腺癌患者提供可靠的理论和实验依据。方法1.DNA双链断裂标志物γ-H2AX及HR修复关键蛋白Rad51和BRCA1表达的检测用VPA临床安全剂量0.5 mmol/L和临界安全剂量1 mmol/L分别预处理MCF7细胞24,48和72h后,给予8Gy电离辐射后恢复6h,用蛋白质免疫印迹实验观察γ-H2AX、Rad51和BRCA1蛋白表达,用免疫荧光方法观察γ-H2AX、Rad51和BRCA1蛋白焦点形成情况。2.MTT和克隆形成实验检测VPA对MCF7细胞放射敏感性的变化取处于对数生长期的MCF7细胞,用VPA 0.5和1 mmol/L分别预处理细胞72h,然后给予4Gy电离辐射后48h,用MTT法检测细胞存活率；MCF7细胞用VPA 0.5 mmol/L预处理24h后,根据每皿接种不同的细胞数目分别给予不同剂量的电离辐射照射：2Gy(500个/皿1000个/皿)、4Gy(2000个/皿和4000个/皿)、6Gy(8000个/皿和16000个/皿),计数克隆形成数量并计算克隆形成率。3.HR修复效率的检测向带有表达重组底物pDR-GFP的MCF7细胞中转染IsceI质粒4h后,分别用VPA 0.5和1 mmol/L处理MCF7细胞24h,收集细胞后,用流式细胞仪测定HR效率。4.细胞周期的检测用VPA 0.5和1 mmol/L分别预处理MCF7细胞24,48和72h后,收集细胞,用冰乙醇固定,流式细胞仪检测前用PI染液进行染色。结果1.应答DNA损伤反应时,VPA对DNA双链断裂标志物γ-H2AX的影响蛋白质免疫印迹实验结果显示,VPA 0.5和1 mmol/L处理后,与正常对照组相比,γ-H2AX表达量均呈增加趋势；VPA预处理后再给予8Gy电离辐射处理,与单独电离辐射组相比,γ-H2AX表达量增加更加明显。免疫荧光实验结果显示,VPA单独作用于MCF7细胞后,就能导致细胞核内γ-H2AX焦点数显著增加,并随着作用时间延长,焦点数目呈逐渐增加的趋势。其中,VPA 0.5 mmol/L分别处理MCF7细胞24,48和72h后,与对照组γ-H2AX焦点形成阳性率(指10焦点/细胞,为5.51%)相比,分别又增加了5.30%(P0.05),7.11%(P0.01)和12.24%(P0.01); VPA 1 mmol/L分别处理MCF7细胞24,48和72h后,与对照组相比γ-H2AX焦点阳性率变化与0.5 mmol/L处理组有相同趋势,也分别增加了9.33%(P0.05),13.91%(P0.01)和17.38%(P0.01)。VPA预处理MCF7细胞不同时间后分别给予8Gy电离辐射,恢复6h时发现所有细胞都有γ-H2AX焦点形成的表现,但根据细胞内γ-H2AX焦点形态将其分为两类：A类细胞(细胞含焦点相对较小且较暗的细胞,代表DNA损伤相对较轻)和B类细胞(细胞含焦点相对较大且明亮的细胞,代表DNA损伤相对较重)。单独电离辐射处理时γ-H2AX焦点的形态主要以A类细胞为主,然而给予VPA预处理24h时就观察到代表损伤较重的B类细胞所占比例明显增加,随预处理时间延长,其比例进一步显著增加,呈时间依赖性。其中,VPA 0.5 mmol/L分别预处理MCF7细胞24,48和72h后,与单独照射组B类细胞所占比例(16.51%)相比,分别增加了12.43%(P0.05),41.46%(P0.01)和54.25%(P0.01); VPA 1 mmol/L分别预处理MCF7细胞24,48和72h后,与单独照射组相比B类细胞所占比例的变化与0.5 mmol/L处理组有相同趋势,也分别增加了31.75%(P0.05),51.19%(P0.01)和54.92%(P0.01)。2.VPA增强MCF7细胞对放射的敏感性MTT与细胞克隆形成实验结果均显示,VPA 0.5和1 mmol/L单独作用于MCF7细胞后,与正常对照组相比均可显著降低细胞克隆形成率(P0.05)。与单独照射处理组相比,VPA 0.5mmol/L预处理MCF7细胞后接受电离辐射能显著降低细胞细胞克隆形成率和细胞存活率(P0.05)；3.VPA导致MCF7细胞HR修复功能障碍与正常对照组相比,VPA处理组HR效率明显降低：VPA 0.5和1 mmol/L处理MCF7细胞24h后与对照组相比,HR效率分别降低42.59%(P0.01)和37.58%(P0.01)。4.VPA通过降低BRCAl和Rad51的表达抑制HR修复过程蛋白质免疫印迹实验结果显示,VPA 0.5和1 mmol/L处理MCF7细胞24h后,BRCA1蛋白表达量与对照组相比呈降低趋势；VPA 0.5和1 mmol/L预处理MCF7细胞24h后再给予8Gy电离辐射处理,Rad51和BRCA1蛋白表达量与单独电离辐射组相比,降低更加明显。免疫荧光实验结果显示,VPA lmmol/L单独处理MCF7细胞24h后,与对照组细胞核内Rad51焦点形成阳性率(指10焦点/细胞,为4.33%)相比,又降低了2.03%(P0.05); VPA 0.5和1 mmol/L预处理MCF7细胞24h再给予8Gy电离辐射后,与单独电离辐射组的Rad51焦点形成阳性率(12.55%)相比降低更加明显,分别降低了6.64%(P0.05)和6.59%(P0.05)。VPA 0.5和1 mmol/L单独处理MCF7细胞72h后,与对照组的细胞核内BRCA1焦点形成阳性率(指10焦点/细胞,为5.13%)相比,分别降低了4.1%(P0.05)和3.84%(P0.05)；VPA预处理MCF7细胞24,48和72h后再给予8Gy电离辐射,恢复6h时发现与单独电离辐射组的BRCA1焦点形成阳性率(38.45%)相比,呈时间依赖性降低,其中VPA 0.5 mmol/L预处理组分别降低了3.48%(P0.05),23.57%(P0.01)和29.22%(P0.01); VPA 1 mmol/L预处理组焦点形成阳性率变化有相同趋势,分别降低了12.71%(P0.05),24.73%(P0.01)和30.83%(P0.01)。5.安全和临界剂量VPA对MCF7细胞周期的影响VPA 0.5和1 mmol/L作用于MCF7细胞后,细胞周期的各时相均未发生显著性变化。结论本课题发现临床安全剂量和临界安全剂量的VPA对乳腺癌细胞MCF7具有如下作用：1.应答DNA损伤反应时, VPA能引起MCF7细胞核内DNA双链断裂损伤的蓄积。2.VPA不仅对乳腺癌细胞MCF7生长具有抑制作用,还能增强细胞对放射的敏感性。3.VPA对MCF7的细胞周期未产生影响。4.VPA可能通过抑制重组蛋白BRCA1和Rad51的活性造成HR修复机制的损害。由于MCF7是细胞凋亡相关的胱天蛋白酶3基因缺失的细胞,再加上在本课题研究条件下VPA对细胞周期无影响,结果还提示BRCA1-Rad51介导的HR.分子机制的破坏是VPA致乳腺癌放射敏感性增强的关键机制。
【关键词】：乳腺癌细胞 丙戊酸 放射增敏 同源重组 BRCA1 Rad51
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 符号说明15-16
• 前言16-24
• 材料与方法24-37
• 实验结果37-47
• 讨论47-55
• 结论55-56
• 参考文献56-63
• 致谢63-64
• 攻读学位期间发表的论文64-65
• 附件65

【参考文献】

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1 牛俊婕;王晗;徐英;周勇;姜玉华;;丙戊酸钠增强大鼠胶质瘤C6细胞放射敏感性的体外实验[J];山东大学学报(医学版);2013年06期

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本文编号：549166