miR-320靶向FOXM1调控结肠癌化放疗敏感性的机制研究

发布时间：2017-07-20 21:16

  本文关键词：miR-320靶向FOXM1调控结肠癌化放疗敏感性的机制研究

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【摘要】：目的:探讨mi R-320对人结肠癌细胞生物学行为、5-FU和奥沙利铂化疗耐药及放射线抵抗的影响,并初步阐明mi R-320逆转人结肠癌细胞耐药及放疗抵抗的机制。方法:1.选择mi R-320相对低表达的HCT116结肠癌细胞及mi R-320相对高表达的HT-29细胞,分别转染mi R-320 mimics及mi R-320 inhibitor,并各自转染无义序列NC为对照组。采用实时定量PCR方法检测结肠癌细胞mi R-320表达变化。2.采用MTT法、克隆形成试验检测转染后四组结肠癌细胞(HCT116-mimics、HCT116-NC、HT-29-inhibitor、HT-29-NC)的增殖能力;采用流式细胞术检测四组结肠癌细胞凋亡和细胞周期;采用Transwell实验检测四组结肠癌细胞迁移及侵袭能力。MTT法检测5-FU和奥沙利铂对四组细胞的抑制率并计算IC50值。MTT法检测经放射线处理后的细胞活性。3.采用双荧光素酶报告基因试验验证mi R-320是否可与FOXM1 3’UTR靶向结合。RT-PCR技术检测mi R-320对FOXM1 m RNA表达水平的影响。Western blot技术检测mi R-320对FOXM1、β-catenin、Cyclin D1、c-myc蛋白表达水平的影响。结果:1.RT-PCR结果显示,转染后mi R-320表达水平在HCT116-mimics组细胞较HCT116-NC组细胞明显升高;HT-29-inhibitor组则较HT-29-NC组明显下降。2.上调mi R-320明显抑制HCT116结肠癌细胞增殖及克隆形成能力,抑制细胞周期进展,抑制细胞迁移及侵袭,并增强细胞对5-FU、奥沙利铂及放射线的敏感性,但不影响细胞凋亡率;下调mi R-320则增强HT-29结肠癌细胞增殖及克隆形成能力,促进细胞周期进展,增强细胞迁移及侵袭能力,并降低细胞对5-FU、奥沙利铂及放射线的敏感性,但不影响细胞凋亡率。3.双荧光素酶报告基因试验中,共转染mi R-320 mimics后荧光素酶活性明显降低,而FOXM1 3’UTR突变组中荧光素酶活性则无明显变化,表明mi R-320可靶向结合于FOXM1 3’UTR区。RT-PCR结果显示,转染后FOXM1 m RNA水平的改变无统计学意义。Western blot结果显示,上调mi R-320后,FOXM1、β-catenin、Cyclin D1、c-myc蛋白水平明显下降;相反,下调mi R-320后,上述蛋白表达量均明显升高。结论:1.mi R-320可抑制结肠癌细胞增殖、细胞周期进展、细胞迁移及侵袭能力,并增强结肠癌细胞对5-FU、奥沙利铂及放射线的敏感性。2.结肠癌细胞中mi R-320可靶向抑制FOXM1表达,这在mi R-320对5-FU、奥沙利铂及放射线敏感性的调控中可能具有重要作用。
【关键词】：miR-320 结肠癌 FOXM1 化疗抵抗 Wnt
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文缩略词表9-10
• 第1章 引言10-14
• 第2章 材料与方法14-31
• 2.1 实验材料14-16
• 2.1.1 实验细胞和培养方法14
• 2.1.2 实验试剂14-16
• 2.2 主要实验设备16-17
• 2.3 实验方法17-30
• 2.3.1 HCT116 和HT-29 结肠癌细胞株的培养17-18
• 2.3.2 miR-320 mimics和miR-320 inhibitor转染结肠癌细胞18
• 2.3.3 荧光显微镜观察结肠癌细胞转染效率18
• 2.3.4 real-time PCR检测结肠癌细胞miR-320 表达18-20
• 2.3.5 MTT法检测细胞增值20
• 2.3.6 平板克隆形成试验20-21
• 2.3.7 流式细胞仪检测细胞周期21
• 2.3.8 流式细胞仪检测细胞凋亡21
• 2.3.9 Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力21-22
• 2.3.10 MTT法检测结肠癌化疗敏感性22-23
• 2.3.11 MTT法检测结肠癌放疗敏感性23
• 2.3.12 生物信息学预测miR-320 靶基因23-25
• 2.3.13 双荧光素酶报告基因试验25-28
• 2.3.14 实时定量PCR检测转染后结肠癌细胞基因m RNA表达量28
• 2.3.15 Western blot检测转染后结肠癌细胞基因蛋白表达量28-30
• 2.4 统计学处理30-31
• 第3章 结果31-42
• 3.1 荧光显微镜观察结肠癌细胞转染效率31
• 3.2 实时定量PCR验证转染效率31-32
• 3.3 miR-320 对结肠癌细胞增殖的影响32-33
• 3.3.1 MTT法检测细胞生长曲线32-33
• 3.3.2 克隆形成试验33
• 3.4. miR-320 对结肠癌细胞周期及细胞凋亡的影响33-35
• 3.4.1 PI单染法检测细胞周期33-34
• 3.4.2 Annexin V-FITC /PI双染法检测细胞凋亡34-35
• 3.5. miR-320 对结肠癌细胞迁移、侵袭能力的影响35-36
• 3.6. miR-320 增加结肠癌细胞对 5-FU及奥沙利铂的敏感性36-38
• 3.7.miR-320 增加结肠癌细胞对放疗的敏感性38
• 3.8.双荧光素酶报告系统的建立及FOXM1 为miR-320 靶基因的验证38-42
• 3.8.1 FOXM13’UTR双荧光素酶报告基因建立38-39
• 3.8.2 荧光素酶活性检测验证FOXM1 为miR-320 靶基因39-40
• 3.8.3 实时定量PCR检测HCT116 及HT-29 细胞中FOXM1 表达情况3040
• 3.8.4 Western blot检测HCT116 及HT-29 细胞中FOXM1 及Wnt通路蛋白表达情况40-42
• 第4章 讨论42-47
• 第5章 结论及展望47-48
• 致谢48-49
• 参考文献49-53
• 攻读学位期间的研究成果53-54
• 综述54-62
• 参考文献60-62
• 附件62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 Jian Yao;Lin-hui Liang;Yu Zhang;Jie Ding;Qi Tian;Jin-jun Li;Xiang-huo He;;GNAI1 Suppresses Tumor Cell Migration and Invasion and is Post-Transcriptionally Regulated by Mir-320a/c/d in Hepatocellular Carcinoma[J];Cancer Biology & Medicine;2012年04期

2 ANNE R.GREENLEE;;MicroRNA Expression Profiles and MiR-10a Target in Anti-benzo[a] pyrene-7,8-diol-9,10-epoxide-transformed Human 16HBE Cells[J];Biomedical and Environmental Sciences;2009年01期

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本文编号：570041