miR-145作用于靶基因PAK4调控结直肠癌转移的分子机制

发布时间：2017-08-01 18:03

  本文关键词：miR-145作用于靶基因PAK4调控结直肠癌转移的分子机制

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【摘要】：目的:本研究拟在体外细胞水平验证mi R-145作用的靶基因为PAK4,明确mi R-145通过调控PAK4而影响肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,进一步探讨mi R-145/PAK4对下游信号通路LIMK1/cofilin的调控。方法:1.通过萤光素酶报告基因检测方法分析mi R-145与PAK4间的相互影响。2.构建过表达mi R-145、沉默PAK4稳定肠癌细胞株,利用MTT、Transwell、Transwell with matrigel方法检测肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力改变。3.利用western blotting方法检测mi R-145过表达和PAK4沉默后对下游LIMK1/cofilin信号通路蛋白的影响。结果:1.构建野生型报告基因质粒psi CHECK2-PAK4-WT和突变型报告基因质粒psi CHECK2-PAK4-MUT,过表达mi R-145的质粒p CDH-mi R-145和空白质粒p CDH-V,将psi CHECK2-PAK4-WT或psi CHECK2-PAK4-MUT与p CDH-mi R-145或p CDH-V共转染HEK293T细胞株,报告基因检测结果显示,mi R-145能抑制野生型报告基因psi CHECK2-PAK4-WT的萤光素酶活性,但对突变型报告基因psi CHECK2-PAK4-MUT萤光素酶活性无明显影响。构建p CDH-anti-mi R-145质粒,将psi CHECK2-PAK4WT或psi CHECK2-PAK4-MUT与p CDH-anti-mi R-145或p CDH-V共转染NCM460细胞株,报告基因检测结果显示,anti-mi R-145能上调野生型报告基因psi CHECK2-PAK4-WT的萤光素酶活性,但对突变型报告基因psi CHECK2-PAK4-MUT萤光素酶活性无明显影响。2.构建过表达mi R-145的SW1116稳定细胞株和沉默PAK4的SW1116稳定细胞株,利用MTT、Transwell、Transwell with matrigel方法检测过表达mi R-145和沉默PAK4对肠癌细胞SW1116增殖、迁移、侵袭能力的影响,结果显示,与对照组相比,过表达mi R-145能抑制肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,沉默PAK4同样也能抑制肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭。3.利用western blotting方法分析,发现过表达mi R-145后LIMK1和cofilin磷酸化水平明显降低,沉默PAK4后同样发现LIMK1和cofilin磷酸化水平明显降低。结论:1.mi R-145作用的靶基因为PAK4。2.mi R-145通过作用于PAK4抑制肠癌细胞的增殖、迁移与侵袭。3.mi R-145作用于靶基因PAK4下调信号通路LIMK1/confilin抑制结直肠癌的侵袭转移。
【关键词】：结直肠癌 mi R-145 PAK4 LIMK1 cofilin 增殖 迁移 侵袭
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 摘要5-7
• abstract7-11
• 绪论11-28
• 1 结直肠癌的发病情况和影响因素11-13
• 2 miRNAs的研究现状13-15
• 3 PAK4的研究现状15-16
• 4 LIMK1/cofilin 信号通路的研究现状16-17
• 5 前期工作和本实验研究内容17-19
• 参考文献19-28
• 实验材料28-31
• 实验方法31-48
• 1 细胞培养31-32
• 2 载体构建32-40
• 3 慢病毒包装和稳定细胞株构建40-42
• 4 细胞增殖检测42
• 5 细胞迁移实验42-43
• 6 细胞侵袭实验43
• 7 报告基因检测43
• 8 western blotting检测43-45
• 9 细胞RNA提取45-46
• 10 逆转录46-47
• 11 q-PCR47-48
• 12 统计学方法48
• 结果48-56
• 1 miR-145 靶基因的验证48-50
• 2 miR-145 通过调控PAK4对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响50-55
• 3 miR-145 调控靶基因下游LIMK1/cofilin信号通路55-56
• 讨论56-64
• 参考文献64-69
• 结论69-70
• 致谢70-71
• 发表论文情况71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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本文编号：605479