PNA-TPP靶向抑制线粒体融合增强人肺腺癌干细胞荷瘤鼠顺铂化疗敏感性的研究

发布时间：2017-08-01 18:17

  本文关键词：PNA-TPP靶向抑制线粒体融合增强人肺腺癌干细胞荷瘤鼠顺铂化疗敏感性的研究

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【摘要】：近几十年来,肺癌的发病率及死亡率逐年增加,已成为严重威胁人们健康的重要疾病之一。肺癌可分为鳞癌、腺癌、腺鳞癌、小细胞癌以及大细胞癌等病理类型,其中,肺腺癌为最常见的病理类型。目前含铂类联合化疗是肺癌治疗的重要手段,但效果仍非常有限。研究发现,肺癌干细胞是导致肺癌耐药、复发和转移的重要原因之一。线粒体,是一个形态结构与分布不断动态变化的细胞器,线粒体内、外膜融合与分裂的精细调控,可能在能量代谢、线粒体DNA稳定性与完整性、细胞器结构完整的维持性以及侵袭与转移等方面起着重要作用,此外,近年来研究发现,线粒体融合可保护肿瘤细胞以免于凋亡。我们前期研究发现,与普通肺癌细胞相比,肺腺癌干细胞线粒体具有融合程度增加的现象,其在肿瘤细胞抗凋亡机制中有独特的作用,这可成为肿瘤治疗靶点。抑制肺腺癌干细胞线粒体融合,提高肺腺癌干细胞对顺铂化疗的敏感性,清除肺腺癌干细胞,对肺癌治疗具有重要临床意义。基于本课题前期研究,肺腺癌干细胞线粒体融合增强,并且增强其耐药性与抗凋亡特性,本研究旨在构建肽核酸-三苯磷复合物,靶向抑制线粒体融合,增强肺腺癌干细胞顺铂化疗敏感性,进而通过构建裸鼠荷瘤模型,肽核酸-三苯磷复合物联合顺铂治疗荷瘤小鼠,以进一步探究肽核酸-三苯磷复合物临床应用研究。目的:1.观察肽核酸-三苯磷复合物(PNA-TPP)干扰肺腺癌干细胞线粒体能量代谢的生物学特性,及线粒体融合相关蛋白的表达;2.构建荷瘤模型,探讨肽核酸-三苯磷复合物(PNA-TPP)靶向抑制肺腺癌干细胞线粒体融合,联合顺铂是否可提高荷瘤小鼠的化疗敏感性。方法:采用无血清培养基(serum-free medium,SFM)的方法将A549细胞诱导成具有干性的A549细胞球;固相肽合成法设计合成肽核酸-三苯磷复合物(PNA-TPP);激光共聚焦显微镜观察PNA-TPP转染后细胞线粒体的形态学变化,检测其转染A549细胞球及A549细胞后ATP含量的变化,Western Blot方法检测转染后干扰线粒体DNA(mt DNA)能量代谢相关蛋白(ATP6与ND6)表达情况,以及线粒体促融合相关蛋白MFN1、MFN2、OPA1和ATAD3A的表达情况;A549细胞与具有干性的A549细胞球分别在NOD-SCID小鼠皮下造模,PNA-TPP联合顺铂治疗荷瘤小鼠,观察肿瘤体积变化以及治疗效果,检测组织中ATP、活性氧(ROS)、胞浆细胞色素c以及肿瘤组织细胞凋亡情况,免疫组化技术(Immuno histochemistry,IHC)检测肿瘤组织促融合蛋白表达情况。结果:1、设计合成PNA-TPP复合物高压液相色谱分析示,14.44 min处可见一单峰,未见明显杂质峰;质谱分析示:复合物分子量为4398.7,符合设计要求。2、A549细胞在无血清培养基(SFM)诱导成A549细胞球;PNA-TPP转染于A549细胞及A549细胞球后,细胞ATP含量的明显下降(P0.05),激光共聚焦观察线粒体分裂程度增加,PNA-TPP分布与线粒体一致,Western Blot法检测线粒体重链与轻链编码蛋白ATP6与ND6表达明显抑制(P0.05),Western Blot法检测线粒体促融合相关蛋白MFN1、MFN2、OPA1和ATAD3A蛋白的表达均下降(P0.05);3、A549细胞与A549细胞球构建荷瘤裸鼠模型,与生理盐水组与顺铂治疗组相比,PNA-TPP联合顺铂治疗荷瘤裸鼠后,肿瘤体积在第四周与第五周统计具有明显趋势(P0.05),组织ATP含量降低(P0.05),PNA-TPP在肿瘤组织中分布与线粒体一致;免疫组织化学检测肿瘤组织中线粒体能量代谢相关蛋白ATP6与ND6、线粒体促融合蛋白MFN1、MFN2、OPA1和ATAD3A表达减少(P0.05);ROS水平增高(P0.05),组织细胞胞浆色素c增加(P0.05),TUNEL检测细胞凋亡数明显增加。结论:1.A549肺腺癌干细胞线粒体促融合蛋白表达较A549细胞增高,PNA-TPP抑制线粒体能量代谢,抑制线粒体融合蛋白表达。2.PNA-TPP抑制裸鼠肿瘤组织线粒体融合蛋白表达,联合可提高其对顺铂化疗的敏感性,促进细胞凋亡。
【关键词】：PNA-TPP 肺腺癌干细胞 线粒体融合
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文缩略词表10-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 材料与方法13-27
• 2.1 实验材料13-18
• 2.1.1 细胞株与实验动物13
• 2.1.2 主要试剂及来源13-14
• 2.1.3 主要仪器和设备14-15
• 2.1.4 主要试剂配制15-18
• 2.2 实验方法18-26
• 2.2.1 PNA-TPP干扰肺腺癌干细胞线粒体融合的研究18-22
• 2.2.2 NOD-SCID荷鼠瘤模型构建及PNA-TPP联合顺铂治疗荷瘤鼠干扰线粒体融合的研究22-26
• 2.3 统计方法26-27
• 第3章 结果27-45
• 3.1 PNA-TPP复合物的鉴定27
• 3.2 A549细胞与A549细胞球形态学，，LCM观察PNA-TPP复合物在A549细胞球及A549细胞内的空间分布及线粒体形态学变化27-29
• 3.2.1 A549细胞及A549细胞球形态学27-28
• 3.2.2 LCM观察线粒体形态学28-29
• 3.3 PNA-TPP转染A549细胞球和A549细胞后ATP浓度检测29-30
• 3.4 Western Blot检测PNA-TPP复合物转染A549细胞和A549细胞球后线粒体重链与轻链蛋白ATP6与ND6表达30-31
• 3.5 Western Blot检测PNA-TPP复合物转染A549细胞和A549细胞球抑制线粒体促融合相关蛋白MFN1、MFN2、OPA1和ATAD3A的表达31-32
• 3.6 裸鼠成瘤实验32-33
• 3.7 PNA-TPP在肿瘤组织中分布情况33-34
• 3.8 肿瘤组织ATP浓度检测34-35
• 3.9 各组肿瘤组织线粒体重链编码蛋白ATP6与轻链编码蛋白ND6免疫组化结果35-37
• 3.10 各组肿瘤组织线粒体融合相关蛋白MFN1、MFN2、OPA1及ATAD3A免疫组化结果37-42
• 3.11 肿瘤组织胞浆细胞色素c浓度检测42-43
• 3.12 肿瘤组织ROS水平检测43-44
• 3.13 各组肿瘤组织细胞凋亡TUNEL实验结果44-45
• 第4章 讨论45-50
• 第5章 结论与展望50-51
• 5.1 结论50
• 5.2 展望50-51
• 致谢51-52
• 参考文献52-56
• 攻读学位期间的研究成果56-57
• 综述57-64
• 参考文献62-64

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本文编号：605557