重组溶瘤痘病毒的构建及对胰腺癌细胞的体外杀伤作用

发布时间：2017-08-06 07:05

  本文关键词：重组溶瘤痘病毒的构建及对胰腺癌细胞的体外杀伤作用

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【摘要】：早在一个世纪前已尝试使用病毒治疗肿瘤。溶瘤病毒是指能够靶向性地杀伤肿瘤细胞却不伤害正常细胞组织的病毒。同时,溶瘤病毒对目前使用的抗肿瘤疗法不产生拮抗作用,比较适合联合用药。目前常对痘苗病毒进行基因改造,构建靶向性强、溶瘤性强且安全性强的溶瘤痘病毒。本研究分两部分,分述如下：第一部分重组溶瘤痘病毒vvDD-GFP-DsRed的构建及对胰腺癌细胞的体外杀伤作用目的成功构建胸苷激酶(thymidine kinase, TK)和痘苗生长因子(vaccinia growth factor, VGF)双基因缺失同时又表达红色荧光蛋白DsRed和绿色荧光蛋白GFP的溶瘤痘病毒,并且研究其在体外对胰腺癌细胞BxPC-3和Patu8988的杀伤效果。方法利用同源重组法在痘病毒TK基因处插入DsRed基因和GFP基因,并将其克隆入缺失VGF基因的VSC20病毒,成功构建VGF和TK双基因缺失的重组溶瘤痘病毒vvDD-GFP-DsRed。使用CCK-8法和结晶紫空斑染色法检测重组病毒在体外对胰腺癌细胞BxPC-3口P atu8988的杀伤效果。结果利用同源重组法和软琼脂筛选法获取高纯度重组溶瘤痘病毒vvDD-GFP-DsRed。CCK-8法结果显示,感染重组病毒vvDD-GFP-DsRed后的BxPC-3细胞和Patu8988田胞存活率与MOI值和时间成负相关(P均0.05)；与MOI=0比较,Patu8988细胞在MOI=0.01时存活率低(P0.05)且在结晶紫空斑染色法中形成了较为明显的空斑。结论成功构建了重组溶瘤痘病毒vvDD-GFP-DsRed,其对BxPC-3细胞和Patu8988田胞均有明显的杀伤效果。第二部分重组溶瘤痘病毒vvDD-EphA2xCD3-DsRed的构建及对胰腺癌细胞的体外杀伤作用目的成功构建携带EphA2xCD3双特异性抗体,同时表达DsRed的VGF和TK双基因缺失的溶瘤痘病毒,并且研究其在体外介导PBMC细胞对胰腺癌细胞BxPC-3和Patu8988的杀伤效果。方法利用同源重组法在痘病毒TK基因处插入EphA2xCD3双特性抗体和DsRed基因,并将其克隆入缺失VGF基因的VSC20病毒,成功构建携带EphA2xCD3双特异性抗体,同时表达DsRed的VGF和TK双基因缺失的重组溶瘤痘病毒vvDD-EphA2xCD3-DsRed。用RT-PCR法检测EphA2在BxPC-3细胞和Patu8988细胞中的表达量；采用CCK-8法和结晶紫空斑染色法检测重组病毒介导PBMC细胞在体外对胰腺癌细胞BxPC-3和Patu8988的杀伤效果,同时用ELISA试剂盒检测收集MOI分别为1,0.1的24 h、48 h、72 h含PBMC细胞组的上清液中IL-2及IFN-γ的表达量。结果利用同源重组法和软琼脂筛选法获取高纯度重组溶瘤痘病毒vvDD-EphA2xCD3-DsRed。EphA2在BxPC-3细胞和Patu8988细胞中均高表达。CCK-8法结果显示,感染重组病毒vvDD-EphA2xCD3-DsRed后的BxPC-3细胞和Patu8988细胞存活率与MOI值和时间成负相关(P均0.05)；与不含PBMC细胞组相比,感染含PBMC细胞的vvDD-EphA2xCD3-DsRed后BxPC-3细胞和Patu8988田胞存活率较低(P均0.05)。与MOI=0比较,Patu8988田胞在MOI=001时存活率低(P0.05)且在结晶紫空斑染色法中形成了较为明显的空斑。ELISA实验结果显示,PBMC细胞与Patu8988细胞共培养实验中,感染wDD-EphA2xCD3-DsRed的PBMC细胞表达IL-2和IFN-y,而感染vvDD-GFP-DsRed的PBMC细胞则不表达IL-2口IFN-γ。结论成功构建了重组溶瘤痘病毒vDD-EphA2xCD3-DsRed,其对BxPC-3细胞和Patu8988田胞均有明显的杀伤效果,且加入PBMC田胞后明显增强重组病毒vvDD-GFP-DsRed对BxPC-3田胞和Patu8988细胞的杀伤作用。
【关键词】：溶瘤痘病毒 vvDD-GFP-DsRed 胰腺癌 溶瘤痘病毒 vvDD-EphA2xCD3-DsRed PBMC 胰腺癌
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.9
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-13
• 英文缩略词表13-14
• 第一章 前言14-18
• 1.1 研究背景14-16
• 1.2 本研究的内容及技术路线16-18
• 1.2.1 本研究的内容16
• 1.2.2 本研究的技术路线16-18
• 第二章 重组溶瘤痘病毒vvDD-GFP-DsRed的构建及对胰腺癌细胞的体外杀伤作用18-39
• 2.1 材料18-21
• 2.1.1 质粒、病毒和菌株18
• 2.1.2 实验试剂18-19
• 2.1.3 主要溶液配制19
• 2.1.4 主要实验仪器19-20
• 2.1.5 引物序列设计20-21
• 2.2 实验方法21-31
• 2.2.1 质粒pSEL2N1-GFP-DsRed的构建21-26
• 2.2.2 贴壁细胞培养26-28
• 2.2.3 痘苗病毒与重组质粒同源重组28-29
• 2.2.4 重组溶瘤痘病毒的空斑筛选和纯化29
• 2.2.5 重组病毒病毒滴度测定29-30
• 2.2.6 重组溶瘤痘病毒的杀伤性检测30-31
• 2.3 统计学处理31
• 2.4 实验结果31-38
• 2.4.1 重组病毒构建示意图31
• 2.4.2 目的片段的PCR扩增31-32
• 2.4.3 重组质粒PCR鉴定结果32-33
• 2.4.4 重组病毒荧光显微镜下验证结果33-34
• 2.4.5 重组病毒的滴度测定结果34
• 2.4.6 重组病毒的杀伤性检测结果34-38
• 2.5 讨论38-39
• 第三章 重组溶瘤痘病毒vvDD-EphA2xCD3-Ds Red的构建及对胰腺癌细胞的体外杀伤作用39-65
• 3.1 材料39-40
• 3.1.1 质粒、病毒和菌株39
• 3.1.2 实验试剂39
• 3.1.3 主要溶液配制39
• 3.1.4 主要实验仪器39
• 3.1.5 引物序列设计39-40
• 3.2 实验方法40-52
• 3.2.1 质粒pSEL2N1-EphA2xCD3-DsRed的构建40-45
• 3.2.2 悬浮细胞培养45-47
• 3.2.3 RT-PCR检测胰腺癌细胞中EphA2 mRNA表达47-49
• 3.2.4 痘苗病毒与重组质粒同源重组49
• 3.2.5 重组溶瘤痘病毒的空斑筛选和纯化49-50
• 3.2.6 重组病毒病毒滴度测定50
• 3.2.7 重组溶瘤痘病毒的杀伤性检测50-51
• 3.2.8 ELISA试验51-52
• 3.3 统计学处理52
• 3.4 实验结果52-62
• 3.4.1 重组病毒构建示意图52
• 3.4.2 目的片段的PCR扩增52-53
• 3.4.3 重组质粒PCR鉴定结果53-54
• 3.4.4 重组病毒荧光显微镜下验证结果54-55
• 3.4.5 EphA2 RNA在胰腺癌细胞中的表达55-56
• 3.4.6 重组病毒的滴度测定结果56
• 3.4.7 重组病毒的杀伤性检测结果56-61
• 3.4.8 ELISA实验结果61-62
• 3.5 讨论62-65
• 第四章 总结和工作展望65-66
• 4.1 总结65
• 4.2 工作展望65-66
• 参考文献66-70
• 综述70-86
• 参考文献77-86
• 致谢86-87
• 攻读硕士期间发表的论文87

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本文编号：628820