盐胁迫下米曲霉的应答机制研究

发布时间：2020-11-22 09:37

　　 米曲霉是一种常见的发酵用微生物,广泛应用于制作豆豉及酿造酱油中。酱油酿造根据发酵工艺的不同,可分为无盐固态发酵、低盐固态发酵和高盐稀态发酵,现在较为常用的为后两种。盐分的存在不仅可以抑制杂菌的生长,还与酱油特殊风味的形成密切相关,但是发酵时的盐分处理同时也会对米曲霉菌株的生长产生抑制作用,因此有必要对米曲霉进行进一步的优化。目前为止,关于米曲霉在盐胁迫下的应答机制鲜有报道,有必要对其进行更深入的研究,为改造和选育更适合应用的米曲霉菌株提供一定的实践依据。基于上,本课题进行了以下方面的研究:1.盐胁迫下米曲霉的生长及代谢物质分析:接种新鲜米曲霉孢子于含0%,5%,10%,15%氯化钠的PDA培养基中,30℃,培养72 h,以盐浓度0%为对照,观察米曲霉的生长情况,测定米曲霉的干生物量和孢子数量。结果显示,对照组干生物量一直处于同时间点最高值,盐胁迫导致了米曲霉生物量的下降,特别是48 h后,干生物量的变化更加明显,盐浓度越高,抑制作用越明显。15%盐浓度培养下,36 h之前,基本不生长。但米曲霉在各盐浓度实验组平板上的生长趋势基本一致,在培养60 h后生物量基本不变化,达到稳定期。盐胁迫下米曲霉分生孢子的产生受到抑制,高盐度组较为明显。对培养72 h的米曲霉菌丝体进行收集,测定胞内脂肪酸种类与含量,并进行转录组测序。结果显示,18碳脂肪酸与16碳脂肪酸的含量占米曲霉总脂肪酸含量的95%以上,米曲霉中的主要脂肪酸是棕榈酸(Palmitic acid,C16:0),硬脂酸(Stearic acid,C18:0),油酸(Oleic acid,C18:1)和亚油酸(Linoleic acid,C18:2)。与0%对照组相比,盐胁迫组中C18含量略高,C16含量略低,不饱和脂肪酸的含量显著高于饱和脂肪酸含量。转录组数据显示,与0%对照组相比,在三个盐度处理组中总共4578个基因显示出差异表达水平,其中有848个基因为3个盐浓度组所共有,15%盐浓度下的差异基因数量要明显多于5%与10%盐浓度组,表明在15%盐度组发生了更为复杂的生物代谢反应,结合代谢通路发现,差异表达基因参与了米曲霉中精氨酸生物合成以及亚油酸生物合成,其中硬脂酸去饱和酶基因表达水平在5%盐浓度时明显上调。2.盐胁迫相关基因在酵母中的功能鉴定:使用qRT-PCR对米曲霉硬脂酸去饱和生成油酸的限速酶基因AoD9D1和AoD9D2进行表达模式分析发现,AoD9D1的表达从适应期变为对数期和稳定期后逐渐增加,而AoD9D2在适应期具有最高表达水平,在对数期和稳定期表达较少,AoD9D1和AoD9D2在盐浓度升高情况下表现出逐渐增加的表达。基因结构分析发现,AoD9D1和AoD9D2均含有FAD和Cyt-b5结构域,进化分析发现,米曲霉AoD9D1和AoD9D2明显属于两组,并且两组都与米曲霉RIB40中的D9D具有较近的亲缘关系,蛋白性质分析发现,AoD9D1基因编码456个氨基酸,分子量约为51.9 kDa,理论等电点为9.10,亲水性平均系数为负值,具有3个跨膜区域,AoD9D2基因编码469个氨基酸,分子量约为53.6 kDa,理论等电点为9.01,亲水性平均系数为负值,其同样具有3个跨膜区域。将AoD9D1和AoD9D2及其结构域共6个基因分别进行载体构建,使用PEG/LiAc法转化野生型和D9D敲除酿酒酵母,进行液体发酵及脂肪酸含量测定。结果显示,异源表达AoD9D1和AoD9D2基因提高了野生型酿酒酵母的耐盐性,其中异源表达AoD9D1基因的菌株耐盐性要略强于异源表达AoD9D2基因的菌株耐盐性。与野生型相比,D9D敲除的酵母菌株表现出较低的耐盐性,当AoD9D1和AoD9D2转化到D9D敲除菌株中时,盐耐受性在7%及更高浓度下明显增强,且AoD9D1转化菌株比AoD9D2转化菌株具有更高的耐盐性。在5%低盐浓度时,结构域转化酵母的生长均受到了不同程度的抑制,而随着盐浓度的升高,AoD9D1基因的两个结构域转化菌株表现更强的盐胁迫耐受性,而AoD9D2基因的两个结构域转化菌株则无此效果。以上酵母菌株脂肪酸数据分析发现,异源表达AoD9D酿酒酵母中不饱和脂肪酸,包括棕榈油酸和油酸的含量明显增高,而饱和脂肪酸,主要包括棕榈酸和硬脂酸的含量则减少,异源表达AoD9D1菌株中脂肪酸含量的变化比异源表达AoD9D2菌株更明显。相较于AoD9D2结构域转化株,AoD9D1结构域的野生型和D9D敲除酿酒酵母转化株呈现出较高水平的不饱和脂肪酸含量。3.AoD9D1基因在米曲霉中的过表达及表型分析:鉴于AoD9D1基因提高酵母耐盐性的积极作用,构建了基因在米曲霉中过量表达的载体,载体上带有红色荧光,便于对基因表达进行定位。采用农杆菌Ti质粒介导法转化米曲霉,进行基因表达定位及菌株胁迫耐受性实验。结果显示,AoD9D1基因在米曲霉中过表达定位于细胞膜上,基因过表达菌株显示出比野生型更强的繁殖能力和盐胁迫耐受性。4.AoD9D1基因作用的转录调控机制研究:利用STRING数据库预测出10个与AoD9D1基因编码去饱和酶存在相互作用的蛋白。进行相关载体构建,通过酵母双杂交系统对AoD9D1基因作用转录调控机制进行研究。结果显示,无机磷酸盐转运蛋白和肽酰脯氨酰顺反异构酶与AoD9D1基因所编码的蛋白存在着蛋白之间的相互作用。
【学位单位】：江西科技师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ920.6;TS201.3
【部分图文】：

图 1-1 米曲霉不饱和脂肪酸合成途径Fig. 1-1 Synthesis of unsaturated fatty acids in Aspergillus oryzae1.4 本文主要工作本课题旨在对米曲霉在盐胁迫下的应答机制进行研究，并对筛选出的个别差异表达基因进行基因功能验证，主要工作如下：1．盐胁迫下米曲霉的生长及代谢物质分析：在 0%，5%，10%，15%盐度PDA 培养基中对米曲霉进行培养，观察记录生长情况，并对菌体进行脂质组和转录组分析。2．盐胁迫相关基因的功能鉴定：通过将脂质组和转录组的分析数据同米曲霉代谢通路相结合，选定两个米曲霉脂肪酸去饱和酶基因作为主要研究对象。分别构建了两个基因的酵母真核表达载体，通过在酿酒酵母中的过表达及回补

第 2 章 盐胁迫下米曲霉的生长及代谢物质分析对盐胁迫培养后的米曲霉菌丝体干燥至恒重，分析天平称量。结果如图 2所示。以 0%的盐浓度为对照组，与对照组干生物量一直处于同时间点最高值相比，盐胁迫导致了米曲霉生物量的下降，特别是 48 h 后，干生物量的变化更加明显，盐浓度越高，抑制越明显。15%盐浓度培养下，36 h 之前，基本不生长。但是米曲霉在各盐浓度实验组平板上的生长趋势基本一致，在培养 60 h 后生物量基本不变化，达到稳定期。

图 2-2 盐胁迫下米曲霉表型左：5%盐浓度下培养 72 小时；右：0%盐浓度下（对照）培养 72 小时Fig. 2-2 The phenotype of A. oryzae under salt stressLeft: The phenotype of A. oryzae after 72 h in the 5% salinity treatment; Right: The phenotypeof A. oryzae after 72 h in the 0% salinity treatment (control)盐胁迫下米曲霉孢子浓度变化如图 2-3 所示。在最初的 36 h 中，在 5%和10%盐度处理中产生的分生孢子比 0%对照中更多，但是这种趋势在培养 48 h后逆转，在整个培养过程中，15%高盐度组中的分生孢子形成受到显著抑制。结果表明盐胁迫下米曲霉分生孢子的产生受到抑制，高盐度组较明显。
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本文编号：2894496