杂交链式反应介导的信号放大策略在大肠杆菌O157:H7检测中应用的研究

发布时间：2024-01-14 10:03

　　大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是一种重要的食源性致病菌,感染人类后会引起发热、恶心、呕吐、腹部绞痛和腹泻等症状,严重时甚至会导致出血性腹泻或溶血性尿毒综合征。根据世界卫生组织的研究报道,人们因食用被E.coli O157:H7污染的肉制品、奶制品以及果蔬制品等食物而导致多次疫情爆发,因此建立准确有效的检测方法对于监控和预防E.coli O157:H7引起的食物中毒具有重要意义。杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)是一种核酸等温信号放大技术,通过目标链与两条发夹探针交替杂交,在无需酶催化作用下,实现核酸信号放大。HCR因其操作简便、设计灵活,并且可以结合不同的信号输出策略而被广泛应用。本研究基于HCR核酸信号放大技术,结合新型阻断(blocker)引物建立了牛奶中E.coli O157:H7的检测方法,各章内容分述如下:第一章综述了杂交链式反应介导的信号输出策略在检测领域中应用的研究进展。第二章建立了 PCR-HCR双信号放大策略用于牛奶中E.coli O157:H7的检测。该方法以E.coli O1...

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摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 前言
    1.2 HCR原理
    1.3 HCR种类
    1.4 HCR介导的信号输出策略
        1.4.1 比色法
        1.4.2 荧光法
        1.4.3 电化学法
        1.4.4 化学发光法
    1.5 HCR检测的应用
        1.5.1 核酸检测
        1.5.2 细菌检测
        1.5.3 其他生物分子的检测
    1.6 HCR存在的不足及发展趋势
    1.7 研究的目的与意义
    1.8 研究的内容
第2章 PCR-HCR双信号放大方法检测E.coli O157:H7的研究
    2.1 前言
    2.2 材料与仪器
        2.2.1 实验菌株
        2.2.2 主要的实验试剂
        2.2.3 主要的实验仪器及设备
        2.2.4 实验相关试剂的配置方法
    2.3 实验方法
        2.3.1 引物和发夹探针设计
        2.3.2 菌株活化及培养
            2.3.2.1 菌株活化
            2.3.2.1 菌株计数
        2.3.3 DNA提取
        2.3.4 PCR扩增及电泳表征
        2.3.5 主要反应条件的优化
            2.3.5.1 修饰引物浓度的优化
            2.3.5.2 SA-MBs孵育时间的优化
            2.3.5.3 SA-MBs反应浓度的优化
            2.3.5.4 发夹探针浓度的优化
            2.3.5.5 HCR反应时间的优化
        2.3.6 PCR信号放大方法在纯菌液中的灵敏度
        2.3.7 PCR-HCR双信号放大方法在纯菌液中的灵敏度
        2.3.8 PCR-HCR双信号放大方法的特异性
        2.3.9 PCR-HCR双信号放大方法在牛奶加标样中的灵敏度
        2.3.10 数据统计分析
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 PCR-HCR双信号放大方法的原理
        2.4.2 发夹探针的设计
        2.4.3 PCR-HCR双信号放大方法可行性验证
            2.4.3.1 电泳验证修饰引物和发夹探针
            2.4.3.2 荧光验证PCR-HCR双信号放大
            2.4.3.3 共聚焦成像验证
        2.4.4 实验条件的优化
            2.4.4.1 修饰引物浓度的优化
            2.4.4.2 SA-MBs孵育时间的优化
            2.4.4.3 SA-MBs浓度的优化
            2.4.4.4 发夹探针浓度的优化
            2.4.4.5 HCR反应时间的优化
        2.4.5 PCR信号放大方法在纯菌液中LOD的确定
        2.4.6 PCR-HCR双信号放大方法在纯菌液中LOD的确定
        2.4.7 PCR-HCR双信号放大方法特异性评价
        2.4.8 PCR-HCR双信号放大方法在牛奶加标样中LOD的确定
    2.5 小结
第3章 HCR结合聚多巴胺检测E. coli O157:H7的研究
    3.1 前言
    3.2 材料与仪器
        3.2.1 实验菌株
        3.2.2 主要的实验试剂
        3.2.3 主要的实验仪器及设备
        3.2.4 实验相关试剂的配置方法
    3.3 实验方法
        3.3.1 引物和发夹探针设计
        3.3.2 PCR扩增及电泳表征
        3.3.3 PDA的制备
        3.3.4 PDA性能评价
        3.3.5 金属盐离子对PDA吸附效果的影响
        3.3.6 反应条件的优化
            3.3.6.1 HCR反应时间的优化
            3.3.6.2 反应缓冲液pH的优化
            3.3.6.3 PDA孵育时间的优化
            3.3.6.4 PDA反应浓度的优化
        3.3.7 HCR结合PDA在纯菌液中的灵敏度
        3.3.8 HCR结合PDA检测E. coli O157:H7的特异性
        3.3.9 HCR结合PDA在牛奶加标样中的灵敏度
        3.3.10 数据分析
    3.4 实验结果
        3.4.1 HCR结合PDA检测E.coli O157:H7的原理
        3.4.2 发夹探针的设计
        3.4.3 PDA的表征
        3.4.4 PDA抗干扰效果
        3.4.5 金属盐对PDA吸附效果的影响
        3.4.6 HCR结合PDA方法可行性验证
            3.4.6.1 电泳验证引物和发夹探针
            3.4.6.2 HCR结合PDA方法的荧光验证
        3.4.7 实验条件的优化
            3.4.7.1 HCR反应时间的优化
            3.4.7.2 反应缓冲液pH的优化
            3.4.7.3 PDA孵育时间的优化
            3.4.7.4 PDA反应浓度的优化
        3.4.8 HCR结合PDA在纯菌液中LOD的确定
        3.4.9 HCR结合PDA的特异性评价
        3.4.10 HCR结合PDA在牛奶加标样中LOD的确定
    3.5 小结
第4章 结论与展望
    4.1 结论
        4.1.1 PCR-HCR双信号放大方法较传统方法可以提高E.coli O57:H7的检测灵敏度
        4.1.2 HCR结合PDA可实现均相体系下E.coli O157:H7的检测
    4.2 展望
致谢
参考文献
附录A 实验试剂和材料
附录B 实验仪器及设备
个人简介
获奖情况
攻读学位期间的研究成果



本文编号：3878021