干旱胁迫下调控木薯MeAP2的转录因子的初步研究

发布时间：2022-02-09 17:40

　　干旱是一个长期存在的世界难题,它影响植物各个阶段的生长发育和生理代谢过程。木薯（Manihot esculenta Crantz）是热带地区重要的粮食作物,为了适应干旱,盐碱,低温,病害等不良环境,在长期的进化中形成了一套复杂、高效的抗逆胁迫响应机制,其中转录因子是一个很关键的因素,其通过与启动子顺式作用元件或与其它转录因子的功能区域相互作用,激活RNA酶、转录复合物从而启动特定基因的转录表达,最后对逆境胁迫做出相应调节。而AP2/EREBP类转录因子参与植物的生长发育、胁迫应答、激素应答、形态建成等多种生理生化反应。因此,本研究筛选了与木薯抗旱相关的MeAP2转录因子基因,通过RT-PCR研究其在干旱胁迫下的表达模式,并通过酵母单杂交技术筛选调控MeAP2基因的转录因子,探索该转录因子与AP2基因在干旱胁迫中的调控关系。具体研究结果如下：1.通过木薯基因芯片杂交与荧光定量RT-PCR从9个MeAP2基因中筛选出2个与抗旱性相关的MeAP2,且其表达模式与之前做过的木薯基因芯片杂交结果相符,经分析,AP2家族成员在干旱胁迫下均诱导表达,其中,MeAP2-1和MeAP2-2在干旱中期有着... 

【文章来源】：海南大学海南省211工程院校

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
1 引言
    1.1 植物抗旱研究
        1.1.1 旱害对植物的影响
        1.1.2 植物抗旱机理
    1.2 木薯概述
        1.2.1 木薯概况
        1.2.2 木薯抗旱研究进展
    1.3 植物抗逆相关的主要转录因子
        1.3.1 AP2/EREBP类转录因子
        1.3.2 bZIP类转录因子
        1.3.3 MYB类转录因子
        1.3.4 WRKY类转录因子
        1.3.5 NAC类转录因子
    1.4 酵母单杂交技术的原理及研究进展
    1.5 高等植物启动子的结构和类型
        1.5.1 高等植物启动子的结构
        1.5.2 真核启动子的类型
    1.6 本研究的目的和意义
    1.7 本研究技术路线
2 实验材料与方法
    2.1 材料与试剂
        2.1.1 干旱处理过程及采样
        2.1.2 质粒与菌种
        2.1.3 试剂及仪器
    2.2 方法与步骤
        2.2.1 MeAP2基因的筛选
        2.2.2 MeAP2基因的RT-PCR定量检测
            2.2.2.1 RNA的提取
            2.2.2.2 cDNA的合成
            2.2.2.3 各基因间扩增效率的鉴定
            2.2.2.4 荧光定量PCR反应
        2.2.3 MeAP2基因启动子的克隆及序列分析
            2.2.3.1 木薯基因组DNA的提取
            2.2.3.2 引物的设计及合成
            2.2.3.3 PCR扩增
            2.2.3.4 PCR产物的回收与纯化
            2.2.3.5 PCR产物克隆测序
            2.2.3.6 启动子序列分析及顺式作用元件的合成
        2.2.4 酵母单杂交诱饵载体(pAbAi-pMeAP2)的构建与鉴定
            2.2.4.1 诱饵载体的构建
            2.2.4.2 诱饵菌株的合成与鉴定
        2.2.5 酵母转化系统Ⅱ
            2.2.5.1 酵母感受态细胞的制备
            2.2.5.2 诱饵载体转化到酵母感受态细胞
        2.2.6 酵母单杂交诱饵菌株的AbA背景浓度筛选
        2.2.7 cDNA文库的构建
            2.2.7.1 木薯离区部位RNA的提取
            2.2.7.2 木薯离区总RNA中polyA+mRNA的提取
            2.2.7.3 cDNA第一链的合成
            2.2.7.4 LD-PCR扩增双链cDNA
            2.2.7.5 双链cDNA的纯化
        2.2.8 诱饵载体与cDNA文库质粒的大规模杂交筛选
            2.2.8.1 抑制诱饵菌株生长的AbA最小浓度筛选
            2.2.8.2 制备酵母感受态
            2.2.8.3 诱饵载体与cDNA文库共转化酵母
        2.2.9 阳性克隆的分离验证
            2.2.9.1 获取单克隆
            2.2.9.2 酵母菌落PCR验证
            2.2.9.3 文库质粒的分离及测析
        2.3.0 阳性克隆的荧光定量表达分析
            2.3.0.1 各个基因的组织特异性表达分析
            2.3.0.2 干旱胁迫下各基因的表达分析
3 实验结果分析
    3.1 木薯在干旱胁迫下的表型
    3.2 RNA提取质量
    3.3 MeAP2基因的选取
    3.4 荧光定量PCR中各基因间扩增效率的分析
    3.5 荧光定量结果分析
    3.6 MeAP2-2基因启动子的克隆
        3.6.1 生物信息学分析获取MeAP2-2基因5’端调控区
        3.6.2 MeAP2-2基因启动子的克隆条件摸索
    3.7 MeAP2-2基因启动子的序列分析
    3.8 调控AP2转录因子的筛选
        3.8.1 诱饵载体的构建
        3.8.2 诱饵菌株的合成鉴定
        3.8.3 AbA背景浓度的筛选
        3.8.4 酵母单杂交cDNA文库的构建
            3.8.4.1 总RNA的提取质量
            3.8.4.2 cDNA双链的合成
        3.8.5 诱饵载体和cDNA文库质粒共转化酵母
        3.8.6 阳性克隆的初步筛选
        3.8.7 cDNA文库质粒分离
    3.9 阳性克隆的分析
    4.0 阳性克隆的荧光定量表达分析
        4.0.1 各基因组织特异性表达
        4.0.2 干旱胁迫下各个基因的表达分析
4 讨论
    4.1 MeAP2-2基因在干旱胁迫下的荧光定量表达分析
    4.2 MeAP2-2基因启动子的序列功能分析
    4.3 酵母单杂交假阳性分析
    4.4 调控MeAP2基因转录因子的筛选
5 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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[2]盐胁迫下构树DREB转录因子基因表达的实时荧光定量PCR分析[J]. 杨帆,丁菲,杜天真.  林业科学. 2010(04)
[3]大豆MYB转录因子基因GmMYBJ6和GmMYBJ7的克隆及表达分析[J]. 杜海,杨文杰,刘蕾,唐晓凤,吴燕民,黄玉碧,唐益雄.  作物学报. 2008(07)
[4]植物抗逆相关ERF转录因子研究综述[J]. 刘武,戴良英.  中国农学通报. 2007(04)
[5]植物旱害及抵御植物旱害途径的研究进展[J]. 侯海军,何云,胡新文,郭建春.  作物杂志. 2005(05)
[6]植物转录因子与基因调控[J]. 李洁.  生物学通报. 2004(03)
[7]贵港试验区水稻低产原因与持续发展对策[J]. 江泽普,韦广泼.  广西农业科学. 2003(S2)
[8]树木抗旱性及抗旱造林技术研究综述[J]. 黎祜琛,邱治军.  世界林业研究. 2003(04)
[9]山菠菜EREBP/AP2类DNA结合蛋白基因的克隆及其耐逆性研究（英文）[J]. 沈义国,闫冬青,张万科,杜保兴,张劲松,刘强,陈受宜.  Acta Botanica Sinica. 2003(01)
[10]酵母单杂交体系——一种研究DNA-蛋白质相互作用的有效方法[J]. 廖名湘,方福德.  中国医学科学院学报. 2000(04)

硕士论文
[1]巴西橡胶树HbWRKY1转录因子基因的克隆与功能鉴定[D]. 张全琪.海南大学 2010



本文编号：3617400