谷氨酸棒杆菌碱基编辑的条件优化

发布时间：2022-10-08 19:17

　　近年来,基于CRISPR/Cas9的碱基编辑技术因其具有不产生DNA双链断裂、无需外源DNA模板、不依赖宿主同源重组修复的优势,已经逐渐发展成为一种强大的基因组编辑工具,在动物、植物、酵母和细菌中得到了开发和应用。研究团队前期已在重要的工业模式菌株谷氨酸棒杆菌中开发了一种多元自动化的碱基编辑技术MACBETH,为进一步优化该方法,提高碱基编辑技术在谷氨酸棒杆菌中的应用效率,本研究首先在谷氨酸棒杆菌中构建了基于绿色荧光蛋白（GFP）的检测系统:将GFP基因的起始密码子ATG人工突变为ACG,GFP无法正常表达,当该密码子的C经编辑后恢复为T,即实现GFP蛋白的复活,结合流式细胞仪分析技术,可快速衡量编辑效率。然后,构建针对靶标位点的碱基编辑工具,经测试,该位点可成功被编辑,在初始编辑条件下碱基编辑效率为（13.11±0.21）%。在此基础上,通过对不同培养基类型、诱导初始OD600、诱导时间、诱导物浓度进行优化,确定最优编辑条件是:培养基为CGXII,初始OD600为0.05,诱导时间为20 h,IPTG浓度为0.01 mmol/L。经过优化,编辑效率达到（30.35±0.75）%,较初... 

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌种和质粒
        1.1.2 酶、引物及相关试剂盒
        1.1.3 培养基
    1.2 方法
        1.2.1 谷氨酸棒杆菌GFP基因的整合
        1.2.2 靶标GFP基因的碱基编辑工具的构建
        1.2.3 谷氨酸棒杆菌的转化
        1.2.4 谷氨酸棒杆菌的培养及碱基编辑
            1)种子培养
            2)诱导培养
        1.2.5 流式细胞仪分析GFP蛋白复活比例
        1.2.6 碱基编辑条件的优化
2 结果与分析
    2.1 谷氨酸棒杆菌GFP荧光检测系统的构建
    2.2 碱基编辑工具复活GFP荧光蛋白
    2.3 碱基编辑条件优化
        2.3.1 培养基类型的优化
        2.3.2 诱导时初始OD600的优化
        2.3.3 诱导时间的优化
        2.3.4 诱导剂浓度的优化
    2.4 最优碱基编辑条件的进一步验证
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]碱基编辑器的开发及其在细菌基因组编辑中的应用[J]. 赵亚伟,姜卫红,邓子新,汪志军,芦银华.  微生物学通报. 2019(02)



本文编号：3688275