从Shh通路电针对缺血性脑卒中的神经的保护与神经干细胞/祖细胞的影响
发布时间：2021-06-03 13:31
前言
缺血性脑卒中属祖国医学“中风”范畴，其主要表现为半身不遂，偏身麻木，口舌歪斜，甚则神昏。在《黄帝内经》中，记载为“薄厥”、“偏风”、“偏枯”等，“阳气者，大怒则形气绝，血郁于上，使人薄厥”等理论至今指导于中医临床对于脑卒中的预防及治疗。中风其病位于脑，与五脏密切相关，其病机主要可由风、火、气、虚、疲、疲引起，这些因素常相互作用而为病。本病本虚标实，其根本为气血虚衰，肝肾阴虚，其标为气血癖阻，痰湿内生，热而化火，气血逆乱而上冲脑络。其中医治疗方法除了补阳还五汤等经典方药外，还有沿用了数千年的针灸疗法。目前临床电针的运用较为广泛，电针能有效地改善脑缺血运动功能受损，是中医促进缺血性中风患者康复的主要治疗手段。研究表明电针能显著改善脑卒中患者软瘫期肢体的肌张力，显著促进患者偏瘫肢体的运动功能改善及恢复?。目前关于电针治疗脑卒中的机制研究，主要集中在抗脂质过氧化反应及自由基损伤、对抗脑缺血后的炎性反应、改善韩超载等[6〕方面。
因此，我们通过制备左侧MCAO再灌注模型，电针脑缺血大鼠患侧肢体“曲池”与“足三里”，观察大鼠神经行为学的改变,观测MCAO大鼠电针后的其脑梗体积变化，检测Shh信号通路相关因子在蛋白水平及基因水平的表达、观测大鼠脑缺血后及缺血再灌电针后nestin、GFAP形态学上的变化，以进一步探索电针治疗脑缺血的机制。
……………
1. 实验材料
1.1实验动物
本实验所选用的实验动物为中国上海斯莱克实验动物有限责任公司所提供的健康雄性Spragure-Dauley大鼠72只，体重为2S0±20g。大鼠于实验动物中心SPF级动物实验室进行适应性喂养，保持恒温恒湿，并模拟标准12h光照及12h黑夜的标准日夜系统，予以自由饮食。
1.2主要实验器械
医用口罩、医用手套、1ml注射器针筒、鼠板、皮筋、无菌纱布、14cin组织剪、14cm止血钳、弯镊、14cm显微镊、方尾5. 5动脉血管夹、羊肠线、缝合针、缝合线、14cm持针甜、渔线、12. Son显微剪、30号华伦牌不绣钢针（0.5寸）、记号笔、G6805电针治疗仪、1.5ml离心管（Axygen)、PCR八连管及八连管帽（美国ABI)、各规格烧杯、玻璃棒、包被多聚赖氨酸载玻片、盖玻片、转膜滤纸、PVDF膜
1.3主要实验试剂及溶液配置
苦味酸、安尔碘、0.9%氯化钠溶液、75%酒精、100%酒精、二甲苯、甲醇、10%水合氯酸、液氮、苏木精溶液、异丙醇、正丁醇、氯仿、DEPC水、4%多聚甲醛、憐酸盐缓冲液（Hyclone，上海）、电泳粉、TBS、Tween-20、一抗稀释液（碧云天）、二抗稀释液（碧云天）、貯檬酸、梓檬酸三钠、逆转录cDNA试剂盒（Ferraentas)、PMSF(碧云天）、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒（碧云天）、BCA工作液（碧云天，上海）、5mg/ml蛋白标准品（碧云天）、脱脂奶粉（碧云天）、DAB试剂盒（福州迈新）、Tris (signmal )、甘氨酸（signmal )、2，3，5-氯化三苯四氮哩（Sigma, USA)、蛋白预染彩虹Marker (Fermentas)、上样缓冲液考马斯亮蓝、shh、nestin 及 glil—抗(Santa Cruz，美国）、Trizol (Invitrogen, CACCC)、e-atin、CDK4、CyclinDl —抗及辣根过氧化物酶二抗（CST，美国），Nestin、GFAP (Abeam公司），SYBE Green (Roche,美国）、shh、glil、CDK4、CyclinDl、GAPDH 引物（上海生工）、RIPA裂解液（碧云天)、湿盒等。
……………
3实验结果...........12
3.1电针大鼠患肢“曲池”及“足三里”穴能显著改善大鼠的神经行为学评分及大鼠的行.......... 12
4.讨论........19
结论.............22
4.讨论
4.1电针与缺血性脑卒中
目前缺血性脑卒中的治疗方式有多种方式，目前临床使用的治疗药物主要为溶栓药物、降纤药物、抗血小板聚集药物、神经保护药物及抗凝药物等[22]，但对肢体功能等神经康复作用局限。而超早期溶栓与急性期神经元保护疗法也因治疗措施收到诸多限制，而仅有少数患者受益[23]。电针疗法是改善缺血性中风神经症状的常用方法，临床报道及实验均证实针灸治疗脑卒中疗效显著，尤其是对神经功能的康复，如'肢体运动、语言、吞咽功能等有促进作用[24]。针刺治疗脑卒中的途径，相关机制研究主要围绕在促进脑血管侧枝循环建立并改善脑血流及脑含氧量、改善脑电活动、抗脂质过氧化反应及自由基损伤、对抗脑缺血后的炎性反应、改善及抑制钙超载等[6]。本实验也证实了电针对脑缺血的神经功能有显著改善。
4. 2电针治疗脑卒中的相关中医学理论
脑卒中在中医属于“中风”病，是以突然昏倒不省人事，伴半身不遂，口角歪斜，为主要临床特点的疾病。多数临床及实验的相关研究多以不同的方法，不同的穴位以治疗脑卒中，有特定穴、巨刺取穴法等。其中“曲池”和“足三里”为阳明经的合穴，“曲池”为大肠经合穴，而“足三里”是足阳明胃经的合穴及胃经的下合穴，两者均具多气多血的特点，可补气养血，扶正祛邪，针对中风病的本虚标实有治本之功；脾胃为五谷之海，为气血生化之源，针刺“足三里”“曲池”可通调腹气，使气机条畅，气血调和，进而能达到活血化瘀的功效；再者，此二穴位于肢体的肘膝关节附近，根据经络的近端治疗作用，及远端治疗作用“经络所过，主治所及”，因而可以对中风遗留的半身不遂进行较为有效地治疗。两个穴位的临床及基础研究均显示疗效显著[14]。《内经》的“治痿独取阳明”，对脑卒中后肢体功能障碍具有指导性的作用。有研究对文献进行整理[25」发现，近年来针刺治疗脑卒中的取穴规律，其选穴以中阳明经的穴位出现频率较高，而阳明经穴则以“足三里”“曲池”出现次数最多，可见“曲池、足三里”为临床最为常用的治疗脑卒中的有效穴。
近年来，人们已经从胚胎及成年动物的脑组织中分离出具自我分化及更新能力的神经千细胞(neural stem cells, NSCs)。NSCs具有多向分化潜能、迁徙能力及良好组织融合性、促进神经元再生和损伤的修复，为脑卒中的治疗提供了新的方法。而有学者提出[2b’，神经干细胞这一概念有待于规范化，在神经的发生发展过程中，最早具分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞能力的可称之为神经祖细胞，而具分化成这些类型的神经单位，才可称之为神经干细胞，而这一概念很难界定，因而称之为神经干细胞/祖细胞较为合理，若这类细胞的可塑性进一步降低，则可称之为神经前体细胞。NSCs对脑卒中的治疗可分为内源性NSCs的激活增殖和外源性NSCs移植。而外源性NSCs移植受免疫因素、移植细胞剂量、移植时间、移植与康复时间窗、致瘤风险影响，其运用还有待于进一步探讨_。
本文编号：8731
缺血性脑卒中属祖国医学“中风”范畴，其主要表现为半身不遂，偏身麻木，口舌歪斜，甚则神昏。在《黄帝内经》中，记载为“薄厥”、“偏风”、“偏枯”等，“阳气者，大怒则形气绝，血郁于上，使人薄厥”等理论至今指导于中医临床对于脑卒中的预防及治疗。中风其病位于脑，与五脏密切相关，其病机主要可由风、火、气、虚、疲、疲引起，这些因素常相互作用而为病。本病本虚标实，其根本为气血虚衰，肝肾阴虚，其标为气血癖阻，痰湿内生，热而化火，气血逆乱而上冲脑络。其中医治疗方法除了补阳还五汤等经典方药外，还有沿用了数千年的针灸疗法。目前临床电针的运用较为广泛，电针能有效地改善脑缺血运动功能受损，是中医促进缺血性中风患者康复的主要治疗手段。研究表明电针能显著改善脑卒中患者软瘫期肢体的肌张力，显著促进患者偏瘫肢体的运动功能改善及恢复?。目前关于电针治疗脑卒中的机制研究，主要集中在抗脂质过氧化反应及自由基损伤、对抗脑缺血后的炎性反应、改善韩超载等[6〕方面。
因此，我们通过制备左侧MCAO再灌注模型，电针脑缺血大鼠患侧肢体“曲池”与“足三里”，观察大鼠神经行为学的改变,观测MCAO大鼠电针后的其脑梗体积变化，检测Shh信号通路相关因子在蛋白水平及基因水平的表达、观测大鼠脑缺血后及缺血再灌电针后nestin、GFAP形态学上的变化，以进一步探索电针治疗脑缺血的机制。
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【学位级别】：硕士
1.1实验动物
本实验所选用的实验动物为中国上海斯莱克实验动物有限责任公司所提供的健康雄性Spragure-Dauley大鼠72只，体重为2S0±20g。大鼠于实验动物中心SPF级动物实验室进行适应性喂养，保持恒温恒湿，并模拟标准12h光照及12h黑夜的标准日夜系统，予以自由饮食。
1.2主要实验器械
医用口罩、医用手套、1ml注射器针筒、鼠板、皮筋、无菌纱布、14cin组织剪、14cm止血钳、弯镊、14cm显微镊、方尾5. 5动脉血管夹、羊肠线、缝合针、缝合线、14cm持针甜、渔线、12. Son显微剪、30号华伦牌不绣钢针（0.5寸）、记号笔、G6805电针治疗仪、1.5ml离心管（Axygen)、PCR八连管及八连管帽（美国ABI)、各规格烧杯、玻璃棒、包被多聚赖氨酸载玻片、盖玻片、转膜滤纸、PVDF膜
1.3主要实验试剂及溶液配置
苦味酸、安尔碘、0.9%氯化钠溶液、75%酒精、100%酒精、二甲苯、甲醇、10%水合氯酸、液氮、苏木精溶液、异丙醇、正丁醇、氯仿、DEPC水、4%多聚甲醛、憐酸盐缓冲液（Hyclone，上海）、电泳粉、TBS、Tween-20、一抗稀释液（碧云天）、二抗稀释液（碧云天）、貯檬酸、梓檬酸三钠、逆转录cDNA试剂盒（Ferraentas)、PMSF(碧云天）、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒（碧云天）、BCA工作液（碧云天，上海）、5mg/ml蛋白标准品（碧云天）、脱脂奶粉（碧云天）、DAB试剂盒（福州迈新）、Tris (signmal )、甘氨酸（signmal )、2，3，5-氯化三苯四氮哩（Sigma, USA)、蛋白预染彩虹Marker (Fermentas)、上样缓冲液考马斯亮蓝、shh、nestin 及 glil—抗(Santa Cruz，美国）、Trizol (Invitrogen, CACCC)、e-atin、CDK4、CyclinDl —抗及辣根过氧化物酶二抗（CST，美国），Nestin、GFAP (Abeam公司），SYBE Green (Roche,美国）、shh、glil、CDK4、CyclinDl、GAPDH 引物（上海生工）、RIPA裂解液（碧云天)、湿盒等。
……………
3实验结果...........12
3.1电针大鼠患肢“曲池”及“足三里”穴能显著改善大鼠的神经行为学评分及大鼠的行.......... 12
4.讨论........19
结论.............22
4.讨论
4.1电针与缺血性脑卒中
目前缺血性脑卒中的治疗方式有多种方式，目前临床使用的治疗药物主要为溶栓药物、降纤药物、抗血小板聚集药物、神经保护药物及抗凝药物等[22]，但对肢体功能等神经康复作用局限。而超早期溶栓与急性期神经元保护疗法也因治疗措施收到诸多限制，而仅有少数患者受益[23]。电针疗法是改善缺血性中风神经症状的常用方法，临床报道及实验均证实针灸治疗脑卒中疗效显著，尤其是对神经功能的康复，如'肢体运动、语言、吞咽功能等有促进作用[24]。针刺治疗脑卒中的途径，相关机制研究主要围绕在促进脑血管侧枝循环建立并改善脑血流及脑含氧量、改善脑电活动、抗脂质过氧化反应及自由基损伤、对抗脑缺血后的炎性反应、改善及抑制钙超载等[6]。本实验也证实了电针对脑缺血的神经功能有显著改善。
4. 2电针治疗脑卒中的相关中医学理论
脑卒中在中医属于“中风”病，是以突然昏倒不省人事，伴半身不遂，口角歪斜，为主要临床特点的疾病。多数临床及实验的相关研究多以不同的方法，不同的穴位以治疗脑卒中，有特定穴、巨刺取穴法等。其中“曲池”和“足三里”为阳明经的合穴，“曲池”为大肠经合穴，而“足三里”是足阳明胃经的合穴及胃经的下合穴，两者均具多气多血的特点，可补气养血，扶正祛邪，针对中风病的本虚标实有治本之功；脾胃为五谷之海，为气血生化之源，针刺“足三里”“曲池”可通调腹气，使气机条畅，气血调和，进而能达到活血化瘀的功效；再者，此二穴位于肢体的肘膝关节附近，根据经络的近端治疗作用，及远端治疗作用“经络所过，主治所及”，因而可以对中风遗留的半身不遂进行较为有效地治疗。两个穴位的临床及基础研究均显示疗效显著[14]。《内经》的“治痿独取阳明”，对脑卒中后肢体功能障碍具有指导性的作用。有研究对文献进行整理[25」发现，近年来针刺治疗脑卒中的取穴规律，其选穴以中阳明经的穴位出现频率较高，而阳明经穴则以“足三里”“曲池”出现次数最多，可见“曲池、足三里”为临床最为常用的治疗脑卒中的有效穴。
近年来，人们已经从胚胎及成年动物的脑组织中分离出具自我分化及更新能力的神经千细胞(neural stem cells, NSCs)。NSCs具有多向分化潜能、迁徙能力及良好组织融合性、促进神经元再生和损伤的修复，为脑卒中的治疗提供了新的方法。而有学者提出[2b’，神经干细胞这一概念有待于规范化，在神经的发生发展过程中，最早具分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞能力的可称之为神经祖细胞，而具分化成这些类型的神经单位，才可称之为神经干细胞，而这一概念很难界定，因而称之为神经干细胞/祖细胞较为合理，若这类细胞的可塑性进一步降低，则可称之为神经前体细胞。NSCs对脑卒中的治疗可分为内源性NSCs的激活增殖和外源性NSCs移植。而外源性NSCs移植受免疫因素、移植细胞剂量、移植时间、移植与康复时间窗、致瘤风险影响，其运用还有待于进一步探讨_。
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实验结论
通路的激活可能参与了电针“曲池”及“足三里”穴对缺血性脑卒中的神经保护作用，改善大鼠的功能障碍缺损，减少脑梗面积，促进巢蛋白及GFAP的表达。
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参考文献（略）
本文编号：8731
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/shuoshibiyelunwen/8731.html