人FXYD6单克隆抗体库的制备及其在胆管癌诊断中的应用

发布时间：2021-10-19 02:58

　　第一部分人FXYD6抗原的表达与纯化目的：构建含人FXYD6胞内区-G4S-FXYD6胞外区-G4S-GST-His6TAG基因序列的原核表达质粒，并诱导其表达，并对表达出的蛋白进行纯化。方法：构建去除FXYD6跨膜区域的FXYD6胞内区-G4S-FXYD6胞外区-G4S基因片段，插入原核表达载体pET30a-GST中，以重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21，SDS-PAGE检测蛋白表达情况，重组蛋白经镍柱纯化后，SDS-PAGE检测蛋白纯度，BCA法检测浓度。结果：成功构建了原核表达载体pET30a-GST-FXYD6，诱导后重组蛋白大小与预期相符在33kD-45kD之间，其纯度在90%以上。结论：成功制备出了FXYD6重组蛋白，为制备FXYD6胞外区和胞内区的单克隆抗体库奠定了基础。第二部分人FXYD6单克隆抗体库的制备与签定目的：研制抗人FXYD6功能区单克隆抗体库，并对其进行签定及筛选分泌胞内、胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法：以去除跨膜区域FXYD6功能区重组蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经多次筛选及克隆化，建立可稳定分泌抗人... 

【文章来源】：苏州大学江苏省 211工程院校

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FXYD6重组基因片段的获得

图 1. FXYD6 重组基因片段的获得 图 2. 重组表达质粒 PCR 签定注：M. DNAmarker 注：M. DNAmarker1. PCR 产物 1. PCR 产物3.2 FXYD6 抗原的表达表达菌 BL21 在 37℃经 0.5mM IPTG 诱导 4 小时后表达出目的蛋白经DS-PAGE 其相对分子质量与预期相符，较诱导前出现明显的梭形条带(如图 3)。

18图 3. FXYD6 抗原诱导表达注：4: 诱导前1. 2. 3. 5: 诱导后M: 蛋白 marker 抗原的纯化破碎后，SDS-PAGE 检测目的蛋白主要集中在上清液 标签，我们选用镍柱纯化目的蛋白，在实验过程中发图 5），较低浓度咪唑就可以将目的蛋白洗脱，确定洗脱目的蛋白，洗脱出的目的蛋白超滤换 PBS 后，右（如图 5）。应用 BCA 蛋白定量方法检测纯化后蛋


本文编号：3444018