结核分枝杆菌GntR/FadR家族转录调控因子Rv0494蛋白的功能研究

发布时间：2021-12-31 04:05

　　结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）是结核病的病原菌。众所周知,结核病是一种慢性呼吸道的传染病,肺部通常最易受侵袭,大约占10%发展为活动性肺结核。结核分枝杆菌是目前致死率最高的致病菌之一[1]。研究表明：每年有上百万的人感染结核病,已经成为死亡率仅次于艾滋病的第二大传染病。尽管最近几十年已经有很多研究致力于研发新药物来治疗结核病,但是由于多重耐药、广泛耐药性结核分枝杆菌的出现,结核分枝杆菌生物膜的形成以及与HIV的共感染[2,3],给人类治疗结核病带来极大的挑战。结核分枝杆菌在面对各种压力环境下,主要通过进化出一系列的修复机制、耐受机制以及自身内部的调控机制来维持其生存和繁殖。其中,结核分枝杆菌自身内部的转录调控机制对其在各种压力环境下的生存、致病性至关重要。目前,有研究表明：结核分枝杆菌的基因组中包含大量的潜在具有转录功能的基因,如GntR家族,因该家族成员和葡萄糖酸盐调控因子具有相似性,故被称为GntR[4]。 GntR家族许多成员已经被证明对结核分枝杆菌在各种压力环境下的存活发挥着重要的作用。该家族的一个显著特点是N末端具有保守的DNA... 

【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－１．ＲＶ０４９４蛋白结合并转录调控的假定侯选基因的功能分类图??－

序列设计ＰＣＲ引物，以结核分枝杆菌Ｈ３７ＲＶ菌株的基因组ＤＮＡ作为模板，以水??作为阴性对照，分别用相应的引物将基因以及其启动子Ｒｖ０４９４ｐ扩增出目的??片段，目的基因大小为７２９ｂｐ，?Ｒｖ０４９４启动子为２００ｂｐ，?ＰＣＲ结果如图４－１Ａ??所示，在５００－７５０?ｂｐ之间有一条带，为目的片段。图４－１Ｂ所示，在２００?ｂｐ左??右有一条带，为启动子目的片段。??Ａ?Ｍ２３４５６?７?８９?Ｂ?Ｍ２?３４?５??２０００?—?２０００??１?概—１０００?－??—?２５０—２００ｂｐ??１００—??图４￣ｌ．?Ｒｖ０４９４目的基因的体外扩增??Ａ：以结核分枝杆菌Ｈ３７ＲＶ的基因组为模板扩增Ｒｖ（Ｍ９４基因，??Ｍ表示ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００，?２－８为目的条带，９为阴性对照??Ｂ：?ＲＶ０４９４启动子的体外扩增，Ｍ表示ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００，２－４为目的条带，５为阴性对照??Ｆｉｇ．?４－１?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｙ?ｔｈｅ?Ｒｖ０４９４?ａｎｄ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｇｅｎｏｍｅ?ｏｆＭ?ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ?Ｈ３７Ｒｖ．??Ａ．?Ｌｉｎｅ?Ｍ，?Ｍａｒｔｅｒ?ＤＬ２０００；?Ｌｉｎｅ?２－８，?Ｒｖ０４９４?ｇｅｎｅ；?Ｌｉｎｅ?９，Ｎｅｇｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ．??Ｂ．?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｙ?ｔｈｅ?Ｒｖ０４９４?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｇｅｎｏｍｅ?ｏｆ?Ｍ．?ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ?Ｈ３７Ｒｖ．??Ｌｉｎｅ?Ｍ

接种阳性单克隆于ＬＢ液体培养基中培养至０￡＞６（）（）＝０．４？０．６时，加终浓度为??２４?ｔｉｇ／ｍＬ的ＩＰＴＧ诱导剂，３７?°Ｃ培养４ｈ诱导目的蛋白表达，然后用１２％?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ??胶检测重组蛋白的表达情况，结果如图４－３Ａ所示。结核菌Ｈ３７ＲＶ?Ｒｖ（Ｍ９４编码２４２??个氨基酸残基的蛋白共２５．９９ｋＤａ，加上ｐＥＴ２８的融合标签则大小约为３１?ｋＤａ。图箭??头所示即为重组蛋白，在大小约３１?ｋＤａ处出现清晰的蛋白条带，但相应对照的空载??菌没有此条带，说明蛋白成功的表达，如图４－３Ｂ所示为纯化的ＲＶ０４９４蛋白。??．?Ｍ?１?２?３?４?５?６??９７．２—??６６．４—??４４．３—??２９．。－?３１?ｋＤａ??２０．１—??１４．３—??Ｂ?ｍｍｍ?ｍｍｒｎｍｍ＇?＜—３１?ｋＤａ??围４－３．?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＢＬ２：ｌ－ｐＥＴ２８－／？ｖ０４９４诱导表达纯化情况??Ａ：?Ｍ?表示蛋白?ｍａｒｋｅｒ，１：?ＢＬ２１－ｐＥＴ２８－／？ｖ０４９４?诱导前全蛋白；２：?ＢＬ２１－ｐＥＴ２８－及诱导??３２??


本文编号：3559585