计算机辅助设计高活性小分子新型SAHA衍生物及其合成与生物活性评价

发布时间：2017-05-02 11:17

  本文关键词：计算机辅助设计高活性小分子新型SAHA衍生物及其合成与生物活性评价，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone Deacetylase Inhibitors,HDACi)凭借其靶点性强、临床应用广泛、治疗毒副作用相对较小等众多优势获得研究者的关注。多年来大量的临床试验结果证明HDACi对多种癌症均有显著的疗效,虽然其抗癌作用机理仍未完全明了。但是,通过组蛋白乙酰化修饰作用影响基因转录活性和表达而发挥作用已经得到很多研究确证。HDACi作用肿瘤细胞后能够抑制肿瘤细胞中失调高度激活表达的组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylases,HDACs),起到提升相应的原抑癌基因的表达水平,从而达到抑制肿瘤细胞无限增值、诱导肿瘤细胞分化、调节细胞周期检查和凋亡,导致促进肿瘤细胞死亡。现今已经有许多HDACi抗癌药物投入到了临床试验阶段上,这些抑制剂中最早通过临床试验成功上市的SAHA已被美国所属的食品药物管理局(FDA)授权实际应用于临床各型肿瘤治疗以及预防中,但十分让人感到可惜的是现阶段研究的HDACi绝大多数为非特异性组蛋白去乙酰化酶抑制剂(nonspecific-HDACi),这就造成了很多临床治疗中出现的副作用,所以导致HDACi在临床上的使用也受到了相当大的应用限制。以经典药物伏立诺他(SAHA)类HDACi的结构为母体结构,结合现代药物设计方法-计算机辅助药物设计(Computer-Aided Drug Design,CADD),设计、合成了一系列新型的SAHA类衍生物,对这些衍生物与HDAC酶的作用方式进行了分析比较,并且对其进行了抗肿瘤实验生物活性评价以及其抗肿瘤的分子机制进行研究和探讨。希望通过对SAHA表面结构区的修饰增加这类抑制剂对HDAC的抑制活性,减少其毒副作用。目的:根据经典的组蛋白去乙酰化酶抑制SAHA的结构特点和分子对接原理,采用计算机辅助设计小分子SAHA类衍生物结构,进行化学合成,然后,通过细胞生物实验,检测其对HDACs的抑制活性、对肿瘤细胞增殖的抑制作用以及对正常细胞的毒性作用,评价其作用于药物靶点的能力、抗肿瘤活性和毒性作用。筛选出具有高活性、低毒性的HDACi,并且对其诱导胶质瘤细胞凋亡和自噬的分子机制进行探讨。方法:分子对接以HDAC8(PDB code 1T69)为筛选模型对比SAHA使用Autodocking等对接软件进行SAHA类衍生物-HDAC8酶活性对接。分析对接结果显示,对接分数比较高的衍生物在理论上能与HDAC8酶亲和性更强。从而筛选出这些高分衍生物,通过酰胺反应和异羟肟酸结合进行合成。CCK-8的方法考察了这些衍生物对人胶质瘤细胞增殖活性抑制作用以及对正常细胞的毒性作用,筛选浓度在0.1μM到30μM之间,研究细胞株为人胶质瘤细胞MGR2、U373、U251和人正常细胞肝细胞LO2、人正常肺细胞MRC5。使用Elisa方法考察了抑制剂对Beclin-1,Caspase-3,9和Bcl-2活性的影响。通过腹腔注射(I.P.)不同浓度的HDACi到小鼠体内,在不同时间点取小鼠脑和肺组织经过研磨破碎,通过HPLC测定抑制剂浓度值,确认HDACi是否能到达靶点器官;Bliss法测定药物在小鼠中的LD50值,考察抑制剂对小鼠的毒副作用。结果:这些抑制剂在与HDAC8分子对接结果中均比阳性对照SAHA分数高,理论上与靶点组蛋白去乙酰化酶有更高的亲和力;在体外抗胶质肿瘤活性研究实验检测结果表明,这些新的SAHA类衍生物均能抑制HDACs和肿瘤细胞增殖,且作用敏感。对比阳性药物SAHA其中以N3F,N2E,N25为代表化合物对于胶质瘤的治疗效果均强于SAHA表现更出色。呈现出对癌细胞高杀伤性,对正常人细胞低毒性的特点。尤其是化合物N3F和N2E表现出色,在U251细胞中N3F的IC50=0.1187μM,正常细胞中毒性低。构效关系研究表明,通过对SAHA表面结构区进行修饰,能够增强这些新衍生物对HDAC酶的抑制作用。其中N3F能明显促进Beclin-1,Caspase-3,9活性,抑制Bcl-2的活性。并且抑制Caspase酶活性后能明提升Beclin-1表达。N25小鼠体内分布研究实验中发现N25能穿过血脑屏障顺利达到靶点器官(脑)从而发挥治疗效果。而且N25在小鼠的毒性反应实验中呈较低毒性(LD50:240.840mg/kg)。以上结果表明对SAHA-Cap结构的修改能得到高活性、低毒性的小分子化合物。结论:根据异羟肟酸类结构特点设计、合成新型的SAHA衍生物,研究了其与HDAC8相互作用,并且对化合物结构进行了波普鉴定。针对胶质瘤进行了一系列细胞活性的筛选,选取较为敏感的细胞株进行HDAC酶活性测定。筛选出活性更高活性的新型SAHA类构造的HDACi。并对活性较高的化合物进行了LD50测定。为今后治疗胶质瘤提供临床候选药物。
【关键词】：分子对接 SAHA衍生物 合成 生物活性 LD50
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914;TP391.72
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一章 前言10-15
• 1.1 胶质瘤发展现状10-11
• 1.2 组蛋白的乙酰化修饰与胶质瘤的治疗11-12
• 1.3 组蛋白去乙酰化酶抑制剂现状12-15
• 第二章SAHA类高活性小分子HDACi的设计、合成和结构鉴定15-28
• 2.1 目标化合物的设计思路15-23
• 2.1.1 SAHA类HDACi的分子模拟16
• 2.1.2 分子对接理论及常用方法16-17
• 2.1.3 AutoDock分子对接软件17-18
• 2.1.4 本论文研究内容18-19
• 2.1.5 HDACs与SAHA类HDACi的相互作用分析19
• 2.1.6 分子模拟方法19-21
• 2.1.6.1 抑制剂配体HDACi的构建19
• 2.1.6.2 酶受体 HDACs 的构建19-21
• 2.1.6.3 分子对接21
• 2.1.7 实验结果21-23
• 2.2 目标化合物的合成和结构鉴定23-26
• 2.3 小结26-28
• 第三章 细胞抗增殖实验28-31
• 3.1 细胞株28
• 3.2 实验试剂28
• 3.3 细胞培养以及接种96孔板28
• 3.4 96 孔板给药处理28-29
• 3.5 细胞增殖测定29
• 3.6 实验结果29-30
• 3.7 小结30-31
• 第四章HDAC活性测定31-32
• 4.1 HDAC抑制率测试试剂盒(HDAC Inhibition Direct Assay Kit)31
• 4.2 试剂配制31
• 4.3 实验步骤31
• 4.4 实验结果31-32
• 第五章HDACi对凋亡和自噬通路相关蛋白的酶联免疫分析(ELISA)32-34
• 5.1 实验目的及其原理32
• 5.2 实验准备工作32
• 5.3 实验方法32-33
• 5.4 Caspase活性抑制后测定Beclin-1 在U251 细胞中的含量变化33
• 5.5 计算33
• 5.6 实验结果33
• 5.7 小结33-34
• 第六章 专利化合物N25 在小鼠体内LD50 值测定以及在组织中的分布34-39
• 6.1 专利化合物N25 在小鼠体内分布状况34-36
• 6.2 LD50值测定36-37
• 6.3 实验结果37-38
• 6.3.1 专利化合物N25 在小鼠脑内分布结果37
• 6.3.2 专利化合物N25 在小鼠肺内分布结果37-38
• 6.3.3 专利化合物N25 在小鼠体内LD50值38
• 6.4 小结38-39
• 第七章 讨论与总结39-45
• 第八章 实验材料、试剂和仪器45-49
• 8.1 合成主要试剂和仪器45-47
• 8.2 细胞实验主要试剂材料和仪器47-49
• 数据处理与分析49
• 财政支持49
• 科研成果49-50
• 致谢50-51
• 参考文献51-56
• 附图56-80

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本文编号：340867